【摘要】：水稻黑條矮縮病是重要的水稻病毒病,嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可造成巨大的產(chǎn)量損失。由于缺乏高抗資源和高效的抗病鑒定方法,使得通過(guò)傳統(tǒng)育種手段難以培育高抗病品種。本實(shí)驗(yàn)室之前證實(shí)在水稻中干涉黑條矮縮病毒基因S6(編碼RNA沉默抑制子)可獲得高抗病轉(zhuǎn)基因水稻,本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化策略,創(chuàng)制具有育種價(jià)值的抗黑條矮縮病轉(zhuǎn)基因水稻新材料,主要進(jìn)展如下:(1)構(gòu)建了黑條矮縮病毒S6基因RNAi結(jié)構(gòu)(S6RNAi)的雙T-DNA植物表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入感病水稻品種武陵粳1號(hào)(WLJ1)中,分別獲得攜帶S6RNAi基因的植株有164株,攜帶HPT基因植株171株,共轉(zhuǎn)化率90%以上。通過(guò)Southern雜交實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)S6RNAi單拷貝轉(zhuǎn)基因植株的比例不足5%,超過(guò)90%的轉(zhuǎn)基因植株攜帶3個(gè)或以上拷貝。經(jīng)過(guò)連續(xù)世代的分子檢測(cè),保留了 25個(gè)單拷貝和雙拷貝轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。Northern-Page雜交結(jié)果顯示,不同轉(zhuǎn)化子或同一轉(zhuǎn)化子的不同株系間的小RNA表達(dá)水平差異明顯。(2)通過(guò)對(duì)單拷貝、雙拷貝及少量多拷貝轉(zhuǎn)基因系的自然接種鑒定,發(fā)現(xiàn)感病對(duì)照的發(fā)病水平基本在30%-50%之間,重復(fù)間及年度間的總體差異不大;在先后測(cè)試的累計(jì)25個(gè)轉(zhuǎn)化子后代株系中,分別發(fā)現(xiàn)9個(gè)抗病轉(zhuǎn)基因系(發(fā)病率在10%以內(nèi),有的甚至在3%以內(nèi))、5個(gè)中等抗性的轉(zhuǎn)基因系(發(fā)病率一般比對(duì)照發(fā)病率的低一半)。對(duì)部分系進(jìn)行了人工接種鑒定,感病對(duì)照的發(fā)病率均在80%以上,比較而言,測(cè)試的轉(zhuǎn)基因系中有2個(gè)系的發(fā)病率低于3%,表現(xiàn)抗黑條矮縮病。小RNA表達(dá)水平高的系基本為較高抗性表型,表達(dá)較弱的系一般為中抗。結(jié)合分子檢測(cè)信息,目前已獲得4個(gè)抗、2個(gè)中抗黑條矮縮病無(wú)標(biāo)記單拷貝轉(zhuǎn)化系。(3)初步測(cè)定了 25個(gè)轉(zhuǎn)化子的后代株系的株高、穗長(zhǎng)和劍葉長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)大多數(shù)株系與對(duì)照間存在1個(gè)或多個(gè)性狀差異,且變異來(lái)源主要為轉(zhuǎn)化過(guò)程中的組培變異。初步發(fā)現(xiàn)3個(gè)抗病單拷貝轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照間的農(nóng)藝表型幾乎一致。(4)通過(guò)反向PCR方法對(duì)9個(gè)單拷貝轉(zhuǎn)基因系的外源基因插入位置進(jìn)行了分析。共獲得3個(gè)系的S6RNAi插入點(diǎn)的一側(cè)旁鄰序列,分別位于第6、8和12條染色體上。通過(guò)設(shè)計(jì)特異PCR引物證實(shí)11-5轉(zhuǎn)基因系中的S6RNAi確實(shí)位于第6染色體的7.69Mb位置。其它單拷貝轉(zhuǎn)化系中外源基因插入位置分析工作仍在進(jìn)行中。
【圖文】：

邐鄒捷抗黑條矮縮轉(zhuǎn)基因水稻育種新材料的創(chuàng)制１．３．水稻黑條矮縮病逡逑１．３．１水稻黑條矮縮病癥狀逡逑水稻黑條矮縮病又被稱為“矮稻病”，主要癥狀是植株矮縮、分蘗增多、葉片色濃綠、新葉會(huì)出現(xiàn)扭曲皺縮＠，葉背的葉脈、葉鞘上會(huì)有不同長(zhǎng)度的短條狀突為蠟白色，后期為黑褐色，不抽穗或很少抽穗。水稻不同生育階段感病的發(fā)病癥同［９］：苗期感病病株葉片僵直，葉色深綠，根系短而少，生長(zhǎng)發(fā)育停滯；分蘗期明顯矮縮，部分病株早枯死亡；拔節(jié)期感病病株嚴(yán)重矮縮，高位分蘗，莖節(jié)倒生莖稈基部有縱向瘤狀乳白色凸起；穗期感病病株全株矮縮叢生，，不抽穗或抽包頸顆粒少，直接影響水稻產(chǎn)量；灌漿期感病發(fā)病較輕的植株株高比正常株低ｌ0－１５ｃ莖基部，節(jié)間可見明顯的蠟白色突起的短條脈腫，呈線狀排列，但不能抽穗的病有這種典型的癥狀

逑１．３．３病毒傳播介體及侵染循環(huán)特征逡逑灰飛虱（圖１．２）是水稻炓條矮縮病主要的傳播介體，屬半翅目、飛虱科，主要分布逡逑在菲律賓至西伯利亞亞洲稻區(qū)和歐洲溫帶地區(qū)Ｐｉ］，最適生長(zhǎng)和繁殖的溫度是２５－２８°Ｃ［２２］，逡逑溫度高于３５°Ｃ若蟲則不能正常羽化，死亡率較高［２３］。２－５齡若蟲能正常越冬，其中以４齡逡逑為主，但是成蟲不能正常越冬［２４］。在適宜的環(huán)境條件下，成蟲、若蟲都可以直接吸食植株逡逑初皮部汁液，從而導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，分蘗推遲，更嚴(yán)重的會(huì)造成植株枯死，出現(xiàn)“虱燒逡逑狀”［２５］�；绎w虱成蟲分雌雄和長(zhǎng)短翅類型，若蟲有５個(gè)齡期。灰飛虱在一年中可產(chǎn)５—６代，逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.11

【參考文獻(xiàn)】

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3 陳揚(yáng)勛;張治國(guó);路鐵剛;;無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年12期

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7 賀媛;朱宇波;侯洋e

本文編號(hào)：2552058