【摘要】：為探討谷子(Setaria italica L.)耐旱抗逆機(jī)制,解析類受體蛋白激酶(receptor like protein kinase,RLKs)基因功能,進(jìn)而為培育谷子抗逆新品種提供依據(jù),本文以干旱處理的谷子"豫谷1號"為材料,通過i TRAQ技術(shù)篩選到1個干旱響應(yīng)的類受體蛋白激酶基因,命名為SiRLK35。以谷子RNA反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲取SiRLK35基因全長序列。應(yīng)用qRT-PCR方法,對SiRLK35在NaCl、PEG、ABA、GA、Me JA等不同處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。進(jìn)一步構(gòu)建基因原核表達(dá)載體pET28a-SiRLK35,結(jié)合斑點法對SiRLK35的抗鹽能力進(jìn)行初步評價。同時構(gòu)建過表達(dá)載體p CAMBIA1301P-SiRLK35轉(zhuǎn)化水稻,并對轉(zhuǎn)基因植株抗鹽能力進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:脅迫及激素處理均可不同程度誘導(dǎo)SiRLK35基因的表達(dá);斑點法研究結(jié)果顯示,在相同NaCl濃度的LB平板上,含有SiRLK35基因的原核表達(dá)載體的大腸桿菌菌株生長狀態(tài)較陰性對照好,SiRLK35具有一定的抗鹽能力;獲得的轉(zhuǎn)SiRLK35基因水稻植株對鹽脅迫的耐受性高于對照。SiRLK35基因?qū)Σ煌{迫均可以產(chǎn)生響應(yīng),但對鹽脅迫的響應(yīng)較為明顯,推測該基因可能在谷子的抗鹽及抗逆過程中發(fā)揮作用。
【圖文】：

416遺傳Hereditas(Beijing)2017第39卷圖1植物表達(dá)載體pCAMBIA1301P-SiRLK35重組質(zhì)粒圖譜Fig.1MapoftherecombinantplasmidofpCAMBIA1301P-SiRLK35傷組織，經(jīng)共培養(yǎng)、潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。參照J(rèn)efferson[18]染色方法對T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色鑒定，按照GUS:GUS緩沖液=1:9的比例配制GUS染液，剪取1~1.5cm轉(zhuǎn)基因水稻葉片置于GUS染液中，以中花11為陰性對照，37℃過夜，使用75%酒精脫色至陰性對照為白色，觀察染色結(jié)果并拍照記錄。參照CTAB法[19]提取轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA，以中花11為對照，并以此基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：引物SiRLK35S11及引物SiRLK35A11各0.5μL、2×EasyTaqSuperMix10μL、cDNA1μL、ddH2O補(bǔ)齊到20μL。反應(yīng)程序94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min20s，34個循環(huán)；72℃10min。1.2.8轉(zhuǎn)基因水稻抗鹽能力檢測選取3個陽性轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為FK3-2、FK3-4、FK3-7，挑選籽粒飽滿的T1代水稻種子于培養(yǎng)皿中，使用含有潮霉素(30mg/L)溶液篩選6~7d后，將抗性苗移入廣口瓶中，，于營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至三葉期，測量地上及地下部分長度，記錄數(shù)據(jù)。之后進(jìn)一步將幼苗分別用0mmol/L、100mmol/L和250mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行處理，以未處理的中花11為對照。觀察比較轉(zhuǎn)基因水稻與中花11在不同鹽濃度脅迫下生長狀態(tài)、表型差異，并拍照記錄。對處理3d后的幼苗，分別測量苗高及根部長度，記錄數(shù)據(jù)。2結(jié)果與分析2.1谷子SiRLK35基因的克隆以谷子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的單鏈cDNA為模板，以SiRLK35S11、SiRLK35A11為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條1200bp左右的條帶，與預(yù)期片段大小一致，進(jìn)一步經(jīng)測序驗證，證明其為目的條帶。2.2谷子SiRLK35基因表達(dá)模式分析2.2.1鹽脅迫、PEG模

第5期王一帆等:谷子SiRLK35基因克隆及功能分析417處理時間的延長，在處理12h后基因表達(dá)受到明顯誘導(dǎo)，其表達(dá)水平約為處理前的15倍，之后基因表達(dá)量隨處理時間的延長而逐漸降低，在NaCl處理24h后基因表達(dá)量下調(diào)至處理前的0.2倍(圖2A)。經(jīng)20%PEG6000模擬干旱處理后，SiRLK35前期表現(xiàn)為誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)量隨處理時間的延長而升高，在處理6h后基因表達(dá)量達(dá)到最高值，較處理前上調(diào)約38倍，之后隨干旱處理時間的延長，基因表達(dá)量有所下降，在干旱處理12h后，基因表達(dá)水平較低，但仍高于對照，為處理前表達(dá)量的5倍，進(jìn)一步處理24h后，基因表達(dá)水平基本沒有改變(圖2B)。自然干旱處理至6d后，SiRLK35基因相對表達(dá)量下降了大約4倍，明顯低于未處理時的水平(圖2C)。2.2.2激素處理下SiRLK35表達(dá)模式分析如圖3所示，在不同激素處理下，SiRLK35具有不同的響應(yīng)模式(圖3)。經(jīng)GA處理6h，基因表達(dá)表現(xiàn)為先上調(diào)后下降，但表達(dá)量變化不大，隨處理時間的延長，經(jīng)GA處理12h之后，基因的表達(dá)較對照明顯降低(圖3A)。而經(jīng)ABA、MeJA處理后，基因表達(dá)趨勢較一致，表現(xiàn)為處理后表達(dá)量略有降低，之后隨處理時間的延長，在處理12h后，表達(dá)量都達(dá)到了較高的水平，其中100μmol/LABA處理12h后，基因表達(dá)量約為未經(jīng)處理的8倍(圖3B)，而100μmol/LMeJA處理12h后，基因表達(dá)量約為處理前的4倍，之后基因表達(dá)量逐漸降低至未處理時的表達(dá)水平(圖3C)。2.3斑點法對SiRLK35抗鹽能力的離體檢測斑點法檢測SiRLK35基因抗鹽性結(jié)果如圖4所示，含有不同質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，其生長均不同程度受到NaCl的抑制，菌落數(shù)量隨所生長平板中NaCl濃度的升高而不同程度的減少；且在相同NaCl濃度的LB平板上，含有pET28a-SiRLK35重組質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株的生長好于含有pET28a空載體的?
【作者單位】： 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心山東省作物遺傳改良與生理生態(tài)重點實驗室;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所;
【基金】：山東省重大科技專項(編號:2015ZDGS03001-2) 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育計劃項目(編號:2015CGPY10) 山東省自然科學(xué)基金面上項目(編號:2016ZRC02178) 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點實驗室開放課題(編號:2015KF15)資助~~
【分類號】：S515


本文編號：2550127