【摘要】：【目的】本研究以多粘類芽胞桿菌為實(shí)驗(yàn)對象,通過共表達(dá)β-葡萄糖苷酶bgl A與bgl B基因,有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性;又將多粘類芽胞桿菌的bgl A、bgl B及內(nèi)切β-葡聚糖酶基因EG分別連接乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)分泌型表達(dá)載體p NZ-X(p NZ8048::usp45),獲得分泌型乳酸菌重組菌株,為重組纖維素酶在食品級菌株中重組表達(dá)提供了一種可行的方案,為秸稈的降解研究奠定了基礎(chǔ)�！痉椒ā�(1)根據(jù)Gen Bank上的多粘類芽胞桿菌bgl A、bgl B、EG基因序列設(shè)計引物,以多粘類芽胞桿菌總DNA為模板,擴(kuò)增bgl A、bgl B、EG基因片段,與p Bluescript II KS(+)載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選出陽性克隆后,提取質(zhì)粒并做雙酶切和測序鑒定;從陽性重組質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得bgl A、bgl B、bgl基因片段,連接p ET-28a載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌C41,構(gòu)建工程菌株命名為EA、EB及共表達(dá)菌株EAB,并將構(gòu)建好的工程菌EA和EB按1:1、1:2、2:1進(jìn)行混合培養(yǎng),分別比較單一酶組分、共表達(dá)及混合表達(dá)菌株的酶活。(2)根據(jù)Gen Bank上的乳酸菌L.lactis MG1363基因序列設(shè)計引物,以L.lactis MG1363總DNA為模板,擴(kuò)增usp45基因片段,與p MD18-T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)質(zhì)粒雙酶切和測序鑒定后,從陽性重組質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得usp45片段,連接p NZ8048后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,獲得分泌型表達(dá)載體p NZ-X。(3)將測序正確的多粘類芽胞桿菌bgl A、bgl B、EG基因從陽性重組質(zhì)粒上切下,分別連接p NZ-X后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,經(jīng)驗(yàn)證正確后,提取重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至L.lactis NZ9000中,經(jīng)乳酸鏈球菌肽(nisin)誘導(dǎo),測定分泌性表達(dá)的Bgl A、Bgl B和EG的酶活性�！窘Y(jié)果】(1)重組β-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中表達(dá):SDS-PAGE電泳圖顯示Bgl A和Bgl B的大小都為50ku,EA和EB混合培養(yǎng)的蛋白大小也為50ku,EAB菌株共表達(dá)的Bgl大小為100ku,表明Bgl A和Bgl B在體外不能形成蛋白復(fù)合物,只有在生物體內(nèi)才能形成Bgl復(fù)合蛋白。酶活測定結(jié)果表明,共表達(dá)Bgl與多粘類芽胞桿菌的酶活差異不顯著,但顯著高于其它組分酶活(P0.05)。剛果紅染色結(jié)果也表明Bgl酶活比單一酶組分的酶活明顯提高。(2)纖維素酶基因在乳酸菌中表達(dá):Bgl A、Bgl B和EG三個酶大小均在50ku;DNS法測定酶活表明重組菌株的酶活顯著低于多粘類芽胞桿菌的酶活(P0.05),但具有一定的活性;剛果紅染色結(jié)果也表明重組乳酸菌分泌產(chǎn)生的酶可產(chǎn)生明顯的水解圈�！窘Y(jié)論】(1)本研究將β-葡萄糖苷酶兩個亞基bgl A和bgl B在大腸桿菌C41中共表達(dá)后,其酶活比單一酶組分及混合表達(dá)的酶活提高了四倍,與原始菌株酶活差別不顯著。(2)本研究分別克隆了多粘類芽胞桿菌的β-葡萄糖苷酶基因bgl A、bgl B及內(nèi)切葡聚糖酶基因EG,并分別與連有信號肽序列的分泌型表達(dá)載體相連接,成功構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體p NZ-X::bgl A、p NZ-X::bgl B及p NZ-X::EG。
【圖文】：

重組質(zhì)粒 pET-28a::bglB 的構(gòu)建策略見圖 2-1A。通過 PCR 方法克隆得到了 B.polymyxabglB 大小為 1358bp，所得 bglB 基因序列與 B.polymyxa 的 bglB 基因（GenBank 登錄號M60211.1）序列比對同源性為 99%。將 bglB 片段連接質(zhì)粒 pET-28a 轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α，構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pET-28a::bglB 經(jīng) BamHⅠ和 XhoⅠ酶切驗(yàn)證無誤后轉(zhuǎn)化 E.coli C41，質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證圖譜如圖 2-2，該結(jié)果說明重組質(zhì)粒 pET-28a::bglB 已成功轉(zhuǎn)入 E.coli C41 中。將得到的 E.coli 重組菌株命名為 EB（pET-28a::bglB）。2.2 bgl 克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-28a::bgl 的構(gòu)建策略見圖 2-1B。利用 PCR 獲得 bglA、bglB 基因片段，雙酶切后連接到質(zhì)粒 pBluescriptⅡKS(+)獲得重組質(zhì)粒 pBluescript ⅡKS(+)::bgl，通過 SmaⅠ和 BamHⅠ酶切驗(yàn)證無誤后（圖 2-2），將 bgl 基因片段從重組質(zhì)粒 pBluescriptⅡKS(+)::bgl上切下并連接質(zhì)粒 pET-28a，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a::bgl，通過 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切驗(yàn)證無誤后（圖 2-2）轉(zhuǎn)化 E.coli C41 挑選陽性重組子提取質(zhì)粒，，測序后證明所得片段正確，說明共表達(dá)重組質(zhì)粒 pET-28a::bgl 已成功轉(zhuǎn)入 E.coli C41 中。將得到的共表達(dá)重組菌株命名為 EAB（pET-28a::bgl）。AB

-。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12750bp2000bp500bp圖 2-2 β-葡萄糖苷酶基因重組質(zhì)粒的雙酶切Fig.2-2 β-glucosidase gene recombinant plasmids digested by BaM：DNA Marker；1：pET-28a::bglA 重組質(zhì)粒 BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切；2組質(zhì)粒 BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切；3：pET-28a；4：pBluescriptⅡKS(+)；5：pBlu重組質(zhì)粒 SmaⅠ和 BamHⅠ雙酶切；6：pET-28a::bgl 重組質(zhì)粒 BamHⅠ和 X1: pET-28a::bglA digested by BamHⅠand XhoⅠ; 2: pET-28a::bglB digested bⅠ; 3: pET-28a; 4: pBluescriptⅡKS(+); 5: pBluescriptⅡKS(+)::bgl digested bⅠ; 6: pET-28a::bgl digested by BamHⅠand XhoⅠ
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：2549852