【摘要】：旨在細胞水平上進一步探討FUT2基因的功能及其在豬小腸上皮細胞受到F18大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)侵染時的調控機制,為提高仔豬對F18大腸桿菌病抵抗力的分子選育提供理論基礎。運用Real-time PCR方法檢測分析FUT2基因在大腸桿菌F18ab、F18ac感染和脂多糖(LPS)誘導小腸上皮細胞前后的mRNA表達差異,并采用Western blotting方法檢測大腸桿菌F18ab、F18ac感染小腸上皮細胞前后FUT2的蛋白表達差異;同時設計并構建豬FUT2基因慢病毒干擾載體,篩選并獲得FUT2基因穩(wěn)定沉默的小腸上皮細胞系,檢測FUT2基因沉默對其所在球系列鞘糖脂生物合成通路其他關鍵基因(FUT1、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1、NAGA)表達以及小腸上皮細胞E.coli F18黏附能力的影響。結果表明,在F18大腸桿菌感染和LPS誘導小腸上皮細胞后,FUT2基因的mRNA相對表達水平均極顯著升高(P0.01),同時大腸桿菌感染后小腸上皮細胞的FUT2蛋白表達上升。此外,本研究成功構建FUT2基因慢病毒干擾載體,并獲得FUT2基因穩(wěn)定沉默的小腸上皮細胞系;FUT2基因沉默后,其所在的球系列鞘糖脂生物合成通路其他關鍵基因的表達都存在不同程度的下降,其中FUT1基因表達水平顯著下調(P0.05),ST3GAL1、HEXA和HEXB基因表達水平極顯著下調(P0.01),而B3GALNT1和NAGA基因表達水平未發(fā)生顯著變化,同時FUT2基因沉默后F18大腸桿菌對小腸上皮細胞的黏附能力顯著降低。結果顯示,FUT2基因低表達可能不利于仔豬大腸桿菌受體的形成,以增強豬小腸上皮細胞抵抗E.coli F18感染的能力,本試驗結果同時為球系列鞘糖脂生物合成通路在仔豬抗大腸桿菌感染過程中的作用機制研究提供一定的理論基礎和依據。
【圖文】：

１）。下表同Ｂｌａｎｋｓｔａｎｄｓｆｏｒｔｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔａｎｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ；＊＊．Ｍｅａｎｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒｅａｔ－ｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ圖１ＦＵＴ２基因在大腸桿菌菌體感染細胞后的ｍＲＮＡ相對表達水平Ｆｉｇ．１ＴｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦＵＴ２ｇｅｎｅｉｎｃｅｌｌｓｉｎ－ｆｅｃｔｅｄｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ圖２０．１μｇ·ｍＬ－１ＬＰＳ誘導ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２基因的表達量Ｆｉｇ．２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＵＴ２ｉｎＩＰＥＣ－Ｊ２ｉｎｄｕｃｅｄｂｙ０．１μｇ·ｍＬ－１ＬＰＳ２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ分析大腸桿菌感染ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２蛋白的表達從圖３可以看出，大腸桿菌Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ感染ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２蛋白表達水平高于對照組。這與ｍＲＮＡ相對定量的結果一致。２．４干擾載體構建與慢病毒液滴度測定通過對所挑取陽性克隆進行測序驗證，最終獲得連接正確的４個干擾和１個陰性對照慢病毒重組質粒載體，分別命名為ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－１、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－２、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－３、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－４和ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－ＮＣ。包裝成功后收集病毒液進行病毒滴度檢測和計算：４個干擾載體滴度均為３×１０８ＴＵ·ｍＬ－１，陰性對照為２×１０８ＴＵ·ｍＬ－１，該滴度水平達到了細胞感染的要求。用

ＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＵＴ２ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＲＮＡｉ表示ＦＵＴ２基因干擾，ＮＣ表示陰性對照。＊表示差異顯著（Ｐ＜０．０５）。下同ＲＮＡｉｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＦＵＴ２ｇｅｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，，ａｎｄＮＣｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．＊ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ圖６ＦＵＴ２基因沉默后ＩＰＥＣ－Ｊ２細胞中各基因的表達Ｆｉｇ．６ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎＩＰＥＣ－Ｊ２ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＦＵＴ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇＢｌａｎｋ表示空白對照Ｂｌａｎｋｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ圖７ＦＵＴ２基因沉默的ＩＰＥＣ－Ｊ２細胞對大腸桿菌的黏附水平的熒光定量結果Ｆｉｇ．７ＴｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓａｂｏｕｔｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｏｆＩＰＥＣ－Ｊ２ｃｅｌｌｓｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｆｔｅｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇＦＵＴ２ｇｅｎｅ２０４１
【作者單位】： 揚州大學動物科學與技術學院江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室;揚州大學教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯(lián)合實驗室;
【基金】：國家自然科學基金(31572360;31372285) 江蘇省重點研發(fā)計劃(現代農業(yè))(BE2015329;BE2016315) 江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)
【分類號】：S858.28

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本文編號：2546129