【摘要】：旨在細胞水平上進一步探討FUT2基因的功能及其在豬小腸上皮細胞受到F18大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)侵染時的調(diào)控機制,為提高仔豬對F18大腸桿菌病抵抗力的分子選育提供理論基礎(chǔ)。運用Real-time PCR方法檢測分析FUT2基因在大腸桿菌F18ab、F18ac感染和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小腸上皮細胞前后的mRNA表達差異,并采用Western blotting方法檢測大腸桿菌F18ab、F18ac感染小腸上皮細胞前后FUT2的蛋白表達差異;同時設(shè)計并構(gòu)建豬FUT2基因慢病毒干擾載體,篩選并獲得FUT2基因穩(wěn)定沉默的小腸上皮細胞系,檢測FUT2基因沉默對其所在球系列鞘糖脂生物合成通路其他關(guān)鍵基因(FUT1、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1、NAGA)表達以及小腸上皮細胞E.coli F18黏附能力的影響。結(jié)果表明,在F18大腸桿菌感染和LPS誘導(dǎo)小腸上皮細胞后,FUT2基因的mRNA相對表達水平均極顯著升高(P0.01),同時大腸桿菌感染后小腸上皮細胞的FUT2蛋白表達上升。此外,本研究成功構(gòu)建FUT2基因慢病毒干擾載體,并獲得FUT2基因穩(wěn)定沉默的小腸上皮細胞系;FUT2基因沉默后,其所在的球系列鞘糖脂生物合成通路其他關(guān)鍵基因的表達都存在不同程度的下降,其中FUT1基因表達水平顯著下調(diào)(P0.05),ST3GAL1、HEXA和HEXB基因表達水平極顯著下調(diào)(P0.01),而B3GALNT1和NAGA基因表達水平未發(fā)生顯著變化,同時FUT2基因沉默后F18大腸桿菌對小腸上皮細胞的黏附能力顯著降低。結(jié)果顯示,FUT2基因低表達可能不利于仔豬大腸桿菌受體的形成,以增強豬小腸上皮細胞抵抗E.coli F18感染的能力,本試驗結(jié)果同時為球系列鞘糖脂生物合成通路在仔豬抗大腸桿菌感染過程中的作用機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
【圖文】：

１）。下表同Ｂｌａｎｋｓｔａｎｄｓｆｏｒｔｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔａｎｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ；＊＊．Ｍｅａｎｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒｅａｔ－ｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ圖１ＦＵＴ２基因在大腸桿菌菌體感染細胞后的ｍＲＮＡ相對表達水平Ｆｉｇ．１ＴｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦＵＴ２ｇｅｎｅｉｎｃｅｌｌｓｉｎ－ｆｅｃｔｅｄｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ圖２０．１μｇ·ｍＬ－１ＬＰＳ誘導(dǎo)ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２基因的表達量Ｆｉｇ．２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＵＴ２ｉｎＩＰＥＣ－Ｊ２ｉｎｄｕｃｅｄｂｙ０．１μｇ·ｍＬ－１ＬＰＳ２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ分析大腸桿菌感染ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２蛋白的表達從圖３可以看出，大腸桿菌Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ感染ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２蛋白表達水平高于對照組。這與ｍＲＮＡ相對定量的結(jié)果一致。２．４干擾載體構(gòu)建與慢病毒液滴度測定通過對所挑取陽性克隆進行測序驗證，最終獲得連接正確的４個干擾和１個陰性對照慢病毒重組質(zhì)粒載體，分別命名為ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－１、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－２、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－３、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－４和ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－ＮＣ。包裝成功后收集病毒液進行病毒滴度檢測和計算：４個干擾載體滴度均為３×１０８ＴＵ·ｍＬ－１，陰性對照為２×１０８ＴＵ·ｍＬ－１，該滴度水平達到了細胞感染的要求。用

ＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＵＴ２ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＲＮＡｉ表示ＦＵＴ２基因干擾，ＮＣ表示陰性對照。＊表示差異顯著（Ｐ＜０．０５）。下同ＲＮＡｉｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＦＵＴ２ｇｅｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，，ａｎｄＮＣｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．＊ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ圖６ＦＵＴ２基因沉默后ＩＰＥＣ－Ｊ２細胞中各基因的表達Ｆｉｇ．６ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎＩＰＥＣ－Ｊ２ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＦＵＴ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇＢｌａｎｋ表示空白對照Ｂｌａｎｋｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ圖７ＦＵＴ２基因沉默的ＩＰＥＣ－Ｊ２細胞對大腸桿菌的黏附水平的熒光定量結(jié)果Ｆｉｇ．７ＴｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓａｂｏｕｔｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｏｆＩＰＥＣ－Ｊ２ｃｅｌｌｓｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｆｔｅｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇＦＵＴ２ｇｅｎｅ２０４１
【作者單位】： 揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室;揚州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31572360;31372285) 江蘇省重點研發(fā)計劃(現(xiàn)代農(nóng)業(yè))(BE2015329;BE2016315) 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)
【分類號】：S858.28

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳思懷;劉燕;唐發(fā)書;;氟化物對體外培養(yǎng)豬小腸上皮細胞的影響[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年03期

2 劉飛飛;車東升;穆成龍;張海全;王波;孫澤威;秦貴信;;兔小腸上皮細胞體外分離培養(yǎng)[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2011年04期

3 王靜;張彥明;仝鋼;劉芳寧;周宏超;何雷;楊小云;徐彥召;洪海霞;;新生仔豬小腸上皮細胞的分離培養(yǎng)和鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2010年01期

4 王曉亮;顧憲紅;鄭冬梅;;雞小腸上皮細胞的分離及體外培養(yǎng)研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年09期

5 鄧宸璽;王自蕊;游金明;瞿明仁;葉亞玲;辛向榮;潘珂;;丙氨酰-谷氨酰胺二肽對仔豬小腸上皮細胞間緊密連接蛋白occludin定位與表達的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2014年03期

6 李融;韓慶廣;趙國琦;;鵝小腸上皮細胞的分離培養(yǎng)研究[J];中國家禽;2009年16期

7 李艷;彭春燕;梁榕旺;趙國琦;金曉君;;雞小腸上皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J];中國畜牧獸醫(yī);2011年02期

8 李慧;格日樂其木格;王健宇;王娟;王芳;薛冰華;劉忠華;;腸絨毛消化法所得仔豬小腸上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定[J];中國細胞生物學(xué)學(xué)報;2011年10期

9 蘇文芹;方熱軍;;降鈣素基因相關(guān)肽對豬小腸上皮細胞鈉離子依賴型Ⅱb磷轉(zhuǎn)運蛋白表達及磷吸收的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2014年09期

10 王大會;齊雪峰;趙獻軍;佟琪;白東寧;王芳;;豬源乳酸桿菌對永生化豬小腸上皮細胞的黏附性能[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2012年07期

相關(guān)會議論文 前3條

1 劉飛飛;車東升;穆成龍;王波;張海全;孫澤威;秦貴信;;兔小腸上皮細胞體外分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化[A];第六次全國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

2 車東升;劉飛飛;穆成龍;王波;張海全;孫澤威;秦貴信;;豬小腸上皮細胞的分離培養(yǎng)研究[A];第六次全國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

3 王曉亮;顧憲紅;;雞小腸上皮細胞的分離及體外培養(yǎng)研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 孫國君;鋅對仔豬及小腸上皮細胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 李玲香;USF1調(diào)控雞小腸上皮細胞中GLUT5和SGLT1表達的研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 張瑜;雞腸道中轉(zhuǎn)錄因子GATA3對SGLT1和GLUT5調(diào)控機制影響的研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 王大會;豬源乳酸菌對永生化豬小腸上皮細胞的黏附性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

4 王海霞;山羊小腸上皮細胞系的建立及其對氮素的利用研究[D];揚州大學(xué);2008年

5 王希笛;日糧銅源及水平對雞小腸上皮細胞銅轉(zhuǎn)運的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 王磊;依普拉芬對體外雞胚小腸上皮細胞新型鈣離子通道表達的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 胡龍昌;神經(jīng)肽Y對豬小腸上皮細胞NaPi-IIb蛋白表達及磷吸收的影響[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 洪智敏;乳酸桿菌對雞小腸上皮細胞抗菌肽AvBD9基因表達的影響[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號：2546129