【摘要】：由木薯褐色條斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和烏干達(dá)木薯褐色條斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色條斑病毒病(CBSD)嚴(yán)重威脅著非洲木薯種植業(yè)的發(fā)展,且目前沒有十分有效的防治方法。病毒侵染植物需要借助植物的翻譯和復(fù)制系統(tǒng)來完成基因組的翻譯及自身的復(fù)制,其中真核翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,e IF4E)是多種RNA病毒侵染植物的必需因子。e IF4E7是木薯編碼的e IF4E基因家族成員之一,本研究構(gòu)建該靶標(biāo)基因的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E7。本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合半定量RT-PCR的方法證明,該載體能高效沉默過量表達(dá)載體p AI-Ca4E7中的e IF4E7基因在本生煙葉片中的表達(dá)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究木薯e IF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及利用RNA技術(shù)干擾植物基因的病毒防治新策略奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

熱帶作物學(xué)報(bào)第38卷M：DL2000DNAMarker；1：目的基因eIF4E7PCR擴(kuò)增；2：過量表達(dá)載體pAI-Ca4E7PCR鑒定；3：含載體pAI-Ca4E7的農(nóng)桿菌EHA105PCR鑒定。M:DL2000DNAMarker;1:PCRamplificationofeIF4E7;2:PCRidentificationofover-expressionvectorpAI-Ca4E7;3:PCRidentificationofAgrobacteriaEHA105harboringover-expressionvectorpAI-Ca4E7.圖3過量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建過程相關(guān)PCR擴(kuò)增與鑒定結(jié)果Fig.3Partofagarosegelelectrophoresisdetectionintheprocessofconstructingover-expressionvectorpAI-Ca4E7M1231000750500250bpM：DL15000DNAMarker；1：載體p18TRNAi；2：中間載體pRNAiCa4E7R；3：中間載體pRNAiCa4E7；4：干擾載體p1300-Ca4E7。M:DL15000DNAMarker;1:p18TRNAi;2:pRNAiCa4E7R;3:pRNAiCa4E7;4:p1300-Ca4E7.圖2干擾載體p1300-Ca4E7構(gòu)建過程相關(guān)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定Fig.2PlasmiddigestedwithrestrictionenzymeEcoRⅠandBamHⅠintheprocessofconstructingmediatingvectorp1300-Ca4E715001000500M1234bp2.4過量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX對(duì)pAI-Ca4E7進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖3泳道2）與目的片段eIF4E7（圖3泳道1）大小一致；用XbaⅠ和XhoⅠ對(duì)pAI-Ca4E7進(jìn)行雙酶切鑒定，切下的小片段與預(yù)期大小一致；由于插入基因ALSV內(nèi)部有1個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)，從載體pAI-ALSV切下2個(gè)小片段（圖4泳道1與泳道2）。鑒定結(jié)果表明eIF4E7基因已插入到pAI表達(dá)載體，，命名為pAI-Ca4E7；經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證可知過量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建成功。采用液氮冷激法將pAI-Ca4E7轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖3泳道3）與目的片段

ntificationofover-expressionvectorpAI-Ca4E7;3:PCRidentificationofAgrobacteriaEHA105harboringover-expressionvectorpAI-Ca4E7.圖3過量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建過程相關(guān)PCR擴(kuò)增與鑒定結(jié)果Fig.3Partofagarosegelelectrophoresisdetectionintheprocessofconstructingover-expressionvectorpAI-Ca4E7M1231000750500250bpM：DL15000DNAMarker；1：載體p18TRNAi；2：中間載體pRNAiCa4E7R；3：中間載體pRNAiCa4E7；4：干擾載體p1300-Ca4E7。M:DL15000DNAMarker;1:p18TRNAi;2:pRNAiCa4E7R;3:pRNAiCa4E7;4:p1300-Ca4E7.圖2干擾載體p1300-Ca4E7構(gòu)建過程相關(guān)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定Fig.2PlasmiddigestedwithrestrictionenzymeEcoRⅠandBamHⅠintheprocessofconstructingmediatingvectorp1300-Ca4E715001000500M1234bp2.4過量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX對(duì)pAI-Ca4E7進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖3泳道2）與目的片段eIF4E7（圖3泳道1）大小一致；用XbaⅠ和XhoⅠ對(duì)pAI-Ca4E7進(jìn)行雙酶切鑒定，切下的小片段與預(yù)期大小一致；由于插入基因ALSV內(nèi)部有1個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)，從載體pAI-ALSV切下2個(gè)小片段（圖4泳道1與泳道2）。鑒定結(jié)果表明eIF4E7基因已插入到pAI表達(dá)載體，命名為pAI-Ca4E7；經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證可知過量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建成功。采用液氮冷激法將pAI-Ca4E7轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖3泳道3）與目的片段eIF4E7（圖3泳道1）大小一致，說明pAI-Ca4E7已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌，形成了工程菌，可用于本生煙瞬時(shí)表達(dá)。2.5半定量RT-PCR檢測(cè)沉默效果為檢測(cè)RNAi載體的沉默效果，分別提取注射農(nóng)桿菌后4dpi、5dpi和6dp
【作者單位】： 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
【基金】：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(No.31461143016,No.31570145)
【分類號(hào)】：S435.33

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本文編號(hào)：2546297