【摘要】：白蠟蟲Ericerus pela Chavannes是我國特有的資源昆蟲,具有特化的泌蠟性狀,其分泌的白蠟廣泛用于機械、輕工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)。蠟酯合酶(wax synthase,WS)是生物蠟酯合成途徑中的關鍵酶之一,目前在昆蟲中尚未鑒定出WS。本研究旨在獲得白蠟蟲蠟酯合酶基因cDNA全長,分析白蠟蟲WS氨基酸序列,并在大腸桿菌中成功表達白蠟蟲WS。實驗結果為后續(xù)白蠟蟲WS抗體制備、組織及亞細胞定位研究奠定基礎,指導功能研究、酶活測定等后續(xù)實驗的順利完成,也為其它昆蟲蠟酯合成研究提供了參考。詳細結果如下:1.白蠟蟲ws基因cDNA全長克隆及序列分析本實驗根據(jù)前期實驗獲得的白蠟蟲ws基因247bp的部分序列,采用Rapid Amplification of cDNA End(RACE)技術獲得白蠟蟲ws基因cDNA全長1518bp,ws基因開放閱讀框1356bp,5’端非編碼區(qū)94bp,3’端非編碼區(qū)68bp。氨基酸序列預測結果顯示,白蠟蟲WS編碼452個氨基酸,分子量為51.8kDa,理論等電點為6.35,脂溶系數(shù)為90.46,在N端具有一個分泌型信號肽,并且在N端存在一個包含22個氨基酸殘基跨膜區(qū)域。根據(jù)WS氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹,顯示白蠟蟲WS并未與已知其他物種WS聚為一支。研究結果顯示白蠟蟲WS的序列結構、跨膜方式、保守區(qū)域都與已知的其他物種WS都不相同,對白蠟蟲WS的鑒定需要更多后續(xù)的研究。2.白蠟蟲WS原核表達通過分析白蠟蟲WS的序列結構,選取其中特異性較好、親水性較高的一段多肽,在序列末端添加組氨酸標簽,設計兩端帶有限制性酶切位點的引物,PCR擴增目的片段。構建原核表達載體pET-22b/EpelWS,并轉化大腸桿菌BL21(DE3),以28℃,1mM IPTG終濃度的條件分別誘導大腸桿菌大量表達目的蛋白。通過SDS-PAGE檢測結果顯示,IPTG誘導的大腸桿菌中出現(xiàn)目的條帶。Western Blot檢測結果顯示,帶有組氨酸標簽的目的蛋白與小鼠抗6×His tag一抗、結合辣根過氧化物酶的二抗發(fā)生特異性結合,證實了白蠟蟲WS在大腸桿菌中大量表達。
【圖文】：

芥中發(fā)現(xiàn)了新的蠟酯合成途徑—脫羰基途徑，區(qū)別于先途徑會先將 C16 和 C18 脂酰輔酶 A 延伸為 C24 至 C34成脂肪醛、仲醇、酮及烷烴。這一途徑多為植物角質層牛等植物中已鑒定出許多角質層蠟合成基因，角質層蠟脂肪醇酯化形成。但由于這一途徑產生許多的中間產物帶來了諸多不便，許多蠟酯合成相關基因的功能尚不清lypina et al., 2008; King et al., 2007; Kunst et al., 2003）。assica napus）中角質層蠟酯合成途徑中編碼合成烷烴的滑表皮性狀的突變株，表皮中蠟酯含量大大減少。這也蠟酯合成途徑屬于脫羰基途徑（Pu et al., 2013）。兩種蠟

圖 1-2 小鼠不同器官中 WS mRNA 的表達水平g.1-2 WS expression levels of mRNAin different organs of mouse（引自 Cheng et al., 20酯在植物中的功能主要包括作為儲能物質及構成角質層。荷荷巴種子中蠟 97％，，在其種子胚乳中存在大量的 WS，蠟酯是種子萌發(fā)最主要的供abal et al., 2000）。Li 在對擬南芥莖干蠟酯合成途徑關鍵酶 WS 的研究發(fā)現(xiàn)僅有 0.1％到 0.2％的蠟酯，莖干中也只有 0.7％到 2.9％。而在巴西rnicia cerifera）葉片蠟層中含有超過 85％的蠟酯（Kolattukudy, 1976），說物中的分布有很大差異。對擬南芥進行 WS 器官特異性模型的分析中，發(fā) 表達水平最高，莖干、葉片次之，WS 在種子和根部僅有痕量表達，說明各物學功能的不同對 WS 分布有重要影響（Li et al., 2008）。通過 Northern B矮牽牛中 WS 在花瓣中表達水平最高，葉片次之（King et al., 2007）。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S899.1

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本文編號：2545695