【摘要】：脂肪組織遍布于全身各處,長期以來一直被認為是機體儲存能量的主要部位。除了儲存多余能量,脂肪組織作為機體內高度活躍的內分泌器官,可分泌產生多種脂肪因子。這些脂肪因子可作用于局部脂肪組織,也可通過血液循環(huán)作用于其他組織器官。它們在生物體內的平衡與能量代謝、心腦血管功能、免疫炎癥等過程密切相關。一旦這種平衡被打破,由此引發(fā)的代謝紊亂、免疫系統異常將會導致肥胖、動脈粥樣硬化以及諸多心腦血管疾病的發(fā)生。因此,對脂肪因子的深入研究,對新脂肪因子的發(fā)現和功能闡明對疾病的診斷、治療和預防都具有非常重大的意義。本課題利用細胞特異性轉基因小鼠和分子特異性抑制劑研究脂肪因子Metrnl和Nampt在機體內的重要功能,并對機制進行了深入研究。本課題分為以下兩個部分。第一部分為Metrnl調節(jié)胰島素敏感性的機制研究。我們前期的研究結果表明,Metrnl是一種分泌蛋白,高表達于小鼠和人的皮下白色脂肪。在限食情況下,白色脂肪中Metrnl的表達會出現下調。而在高脂飲食(High fat diet,HFD)喂養(yǎng)的肥胖小鼠中,白色脂肪的Metrnl會出現顯著升高。此外,Metrnl的表達在白色脂肪細胞分化過程中也會顯著增加。一系列結果提示Metrnl作為一種脂肪因子,可能參與調節(jié)白色脂肪的生物學功能和能量代謝。我們前期利用基因工程手段制備了脂肪細胞特異性過表達Metrnl小鼠(Metrnl-Tg)以及脂肪細胞特異性敲除Metrnl小鼠(Metrnl-/-)。在這部分實驗中,我們首先對Metrnl-/-小鼠的鑒定方法進行了改進和優(yōu)化,建立了Metrnl細胞特異性敲除小鼠鑒定方法的標準操作流程。運用葡萄糖耐量實驗(GTT),我們再次驗證Metrnl-/-將會加重HFD引起的胰島素抵抗,而脂肪細胞特異性過表達Metrnl可以對抗HFD或者瘦素缺乏引起的胰島素抵抗。在胰島素信號通路的研究中我們發(fā)現,Metrnl可顯著提高白色脂肪胰島素作用下AKT的磷酸化水平。為了進一步明確Metrnl增敏作用的機制,我們運用多種實驗手段,對調節(jié)胰島素敏感性的多種機制進行了探索。研究結果表明,Metrnl可抑制炎癥因子的表達、改善脂質代謝、促進脂肪分化從而提高胰島素敏感性。我們還檢測到Metrnl在脂肪組織和成熟脂肪細胞中的分泌,并證實Metrnl可通過分泌的形式促進脂肪細胞的分化。使用PPARγ小分子化學抑制劑或者PPARγ干擾慢病毒可以阻斷Metrnl的胰島素增敏作用,證明了Metrnl可通過PPARγ參與機體胰島素敏感性的調節(jié)。通過這一部分實驗,我們闡明了Metrnl在白色脂肪中的重要功能。脂肪組織Metrnl可通過PPARγ信號通路促進脂肪細胞分化、改善代謝、抑制炎癥從而調節(jié)脂肪功能,對抗肥胖引起的胰島素抵抗,有望成為治療代謝綜合征和2型糖尿病的新靶點。第二部分為Nampt在限食調節(jié)氧化應激以及線粒體生物合成中的作用。限食也被稱為飲食干預,是一種限制能量攝入的飲食調理手段。限食在延緩衰老、改善代謝、預防多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。SIRT家族是介導限食效應的關鍵分子,SIRT活性依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的生物合成。煙酰胺磷酸核糖轉移酶(Nampt)是NAD+生物合成中的重要限速酶,我們前期的實驗結果證明了Nampt參與限食介導的代謝功能改善作用。在這部分實驗中,我們使用Nampt特異性化學抑制劑FK866全身性抑制Nampt酶活性,發(fā)現限食介導的SIRT3活性的增強、氧化應激水平的下降、抗氧化能力以及線粒體生物合成能力的增強都會被取消,證明了Nampt在限食調節(jié)氧化應激以及線粒體生物合成中的重要作用。
【圖文】：

現較明顯的條帶，只是條帶亮度略有差別（圖 1，圖 2）判斷小鼠基因型，判斷的結果極有可能出現假陰性或者因小鼠的培育工作造成很大的困擾。理論知識并結合實際操作經驗，認為造成上述鑒定結果幾個方面：①在小鼠剪尾過程中，由于使用的是同一把剪刀未完全擦拭干凈，導致上一個鼠尾樣本的殘留組織樣本中，造成不同個體間基因組有交叉污染。②不同鼠同，造成樣本之間基因組 DNA 濃度不同，目的片段擴帶亮度不同。③目的基因擴增使用的反應酶特異性不夠性較強，擴增出與目的基因片段大小接近的非特異性片了相應調整并做了如下比較實驗：①比較同一把剪刀會造成鑒定結果差異。②在 PCR 擴增體系中增設內參組 DNA 濃度差異造成的結果判斷失誤，亦可排除 DN結果。 ③比較常規(guī)普通基因組 PCR 擴增酶 Primix Taq HiFi PCR SuperMix 對 Cre 基因擴增特異性差異。我們條件進行了比較實驗。比較實驗結果如下：

圖 2.不同剪刀剪尾，使用 Primix Taq PCR 擴增酶gure 2 Genotyping of Fabp4-Cre using different scissors and 圖 3.同一把剪刀剪尾，，使用 TransTaq HiFi PCR SuperMFigure 3 Genotyping of Fabp4-Cre using a same scisTransTaq HiFi PCR SuperMix
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：2545688