【摘要】：水稻稻瘟病抗性新基因OsAAA1是一種誘導(dǎo)型的廣譜抗病基因,但OsAAA1的表達模式及調(diào)控機理未知。為了研究OsAAA1的表達模式及調(diào)控機理,通過對OsAAA1啟動子序列的生物信息學分析,克隆了3個OsAAA1啟動子區(qū)域的缺失體,將上述缺失體轉(zhuǎn)入植物雙元表達載體DX2181G中。通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR檢測和質(zhì)粒DNA酶切鑒定并測序確認,結(jié)果表明以上3個啟動子系列缺失載體構(gòu)建成功。為進一步研究OsAAA1啟動子的表達模式及該基因的調(diào)控機理提供了參考依據(jù)。
【圖文】：

克隆質(zhì)粒均切出了載體帶和目的帶，為陽性質(zhì)粒(圖4)。菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定為陽性的克隆經(jīng)Sanger測序正確后保存，，綜合以上結(jié)果表明OsAAA1啟動子缺失系列片段載體構(gòu)建成功。2討論本研究成功構(gòu)建了3個啟動子缺失系列載體，下一步是將成功構(gòu)建的載體進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定后，進行GUS組織化學染色和GUS酶活熒光定量分析來研究OsAAA1啟動子的表達模式和OsAAA1基因的調(diào)控機制。通過對OsAAA1啟動子序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子含有多種與植物抗病性有關(guān)的順式作用元圖2啟動子缺失片段P0重組載體菌落PCR鑒定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP0Note:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0圖3啟動子缺失片段P1和P2重組載體菌落PCR鑒定注:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1Figure3ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP1andP2Note:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1圖1OsAAA1基因啟動子缺失片段的PCR擴增注:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P2Figure1PCRamplificationofOsAAA1genepromoterdeletionfragmentsNote:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P22908

表達載體DX2181G，以期研究OsAAA1基因的表達模式，為進一步闡釋該基因的調(diào)控機理提供了參考依據(jù)。1結(jié)果與分析1.1OsAAA1啟動子缺失片段的克隆以日本晴基因組DNA為模板擴增OsAAA1啟動子區(qū)域的缺失體P0、P1、P2(圖1)，其大小分別為2893bp、1099bp、506bp。PCR擴增結(jié)果表明，目的條帶大小與預(yù)期一致，可以用于后續(xù)實驗。1.2菌落PCR檢測將克隆到的目的片段回收后與載體DX2181G質(zhì)粒DNA連接，挑取單克隆進行菌落PCR檢測，結(jié)果顯示擴增得到的目的帶大小依次為2893bp、1099bp、506bp(圖2;圖3)。P0片段重組載體3個單克隆均擴出目的帶，P2片段重組載體3個單克隆有2個擴出目的片段，P1片段重組載體3個單克隆均擴出目的片段。1.3質(zhì)粒酶切檢測將菌落PCR檢測到的陽性克隆擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，用SalⅠ酶進行酶切檢測，P0挑取了3個單克隆質(zhì)粒，P1、P2均挑取2個單克隆質(zhì)粒，結(jié)果顯示：以上7個單克隆質(zhì)粒均切出了載體帶和目的帶，為陽性質(zhì)粒(圖4)。菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定為陽性的克隆經(jīng)Sanger測序正確后保存，綜合以上結(jié)果表明OsAAA1啟動子缺失系列片段載體構(gòu)建成功。2討論本研究成功構(gòu)建了3個啟動子缺失系列載體，下一步是將成功構(gòu)建的載體進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定后，進行GUS組織化學染色和GUS酶活熒光定量分析來研究OsAAA1啟動子的表達模式和OsAAA1基因的調(diào)控機制。通過對OsAAA1啟動子序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子含有多種與植物抗病性有關(guān)的順式作用元圖2啟動子缺失片段P0重組載體菌落PCR鑒定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragm
【作者單位】： 中南民族大學生命科學學院武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室生物技術(shù)國家民委重點實驗室;
【基金】：國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2014ZX0800904B) 國家自然科學基金面上項目(31370306)共同資助
【分類號】：Q943.2;S511

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本文編號：2540879