【摘要】：本研究對(duì)燈盞花ARC1基因進(jìn)行克隆及序列分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)測(cè)燈盞花的序列設(shè)計(jì)引物,以燈盞花花蕾為材料提取RNA作為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)擴(kuò)增得到cDNA,作為PCR擴(kuò)增的模板,將擴(kuò)增的ARC1基因連接到p MD19-T上,陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序結(jié)果分析,得到2 199 bp的核酸序列。序列分析結(jié)果表明,該基因存在2個(gè)結(jié)構(gòu)域,不存在內(nèi)含子,編碼733個(gè)氨基酸,其核酸序列的同源性達(dá)到64%以上,氨基酸序列同源性達(dá)61%。本研究首次從燈盞花中克隆出ARC1基因,為后期研究該基因提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

餉蟣簧稈〕觶圇廡┗餉蚩贍懿斡氳普禱ǖ淖越徊?親和反應(yīng)。本研究利用RT-PCR克隆了ARC1基因，再利用MEGA等多種生物信息學(xué)工具對(duì)-ARC1基因開(kāi)放閱讀框、同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，意在分析菊科自交不親和信號(hào)傳遞路徑中相關(guān)蛋白的功能作用，為菊科自交不親和信號(hào)傳遞機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。1結(jié)果與分析1.1總RNA的提取及檢測(cè)以燈盞花花蕾為材料提取總RNA，更換新的1×TAE緩沖液，0.1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行短時(shí)間的電泳檢測(cè)，結(jié)果表明：28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA的條帶清晰，且28S的量接近18S的2倍(圖1)，說(shuō)明提取的RNA具有完整性，A260/A280在1.8~2.0之間，證明RNA的純度可以用于后續(xù)進(jìn)一步的研究。1.2RT-PCR擴(kuò)增cDNA為模板是通過(guò)總RNA反轉(zhuǎn)錄得到，用P1和P2對(duì)ARC1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳圖1燈盞花花蕾總RNA凝膠電泳Figure1TotalRNAgelelectrophoresisofErigeronbreviscapusbuds檢測(cè)大約2200bp(圖2)，且上下無(wú)雜帶，大小與目標(biāo)基因一致，可能是ARC1基因片段，需一步鑒定。1.3陽(yáng)性克隆的鑒定將擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后連接到pMD19-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基上，過(guò)夜，從轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取5個(gè)克隆并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，其大小約為2200bp(圖3)，與RT-PCR結(jié)果一致，表明這些克隆可能為陽(yáng)性克隆，挑其中兩個(gè)單克隆進(jìn)行搖菌，提取質(zhì)粒送測(cè)序。圖2ARC1基因RT-PCR電泳檢測(cè)注:M:DNAmarker;1,2:RT-PCR產(chǎn)物Figure2ElectrophoresisdetectionofARC1geneRT-PCRproductsNote:M:DNAmarker;1,2:RT-PCRproducts圖3ARC1基因重組質(zhì)粒PCR電泳檢測(cè)注:M:DNAmarker:1~5:陽(yáng)性克隆Figure3Electrophoresisdetecti

因片段，，需一步鑒定。1.3陽(yáng)性克隆的鑒定將擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后連接到pMD19-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基上，過(guò)夜，從轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取5個(gè)克隆并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，其大小約為2200bp(圖3)，與RT-PCR結(jié)果一致，表明這些克隆可能為陽(yáng)性克隆，挑其中兩個(gè)單克隆進(jìn)行搖菌，提取質(zhì)粒送測(cè)序。圖2ARC1基因RT-PCR電泳檢測(cè)注:M:DNAmarker;1,2:RT-PCR產(chǎn)物Figure2ElectrophoresisdetectionofARC1geneRT-PCRproductsNote:M:DNAmarker;1,2:RT-PCRproducts圖3ARC1基因重組質(zhì)粒PCR電泳檢測(cè)注:M:DNAmarker:1~5:陽(yáng)性克隆Figure3ElectrophoresisdetectionofARC1generecombinantplasmidPCRproductsNote:M:DNAmarker;1~5:Positiveclones燈盞花ARC1基因的克隆及序列分析CloningandSequenceAnalysisofARC1GenefromErigeronbreviscapus4390
【作者單位】： 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院;西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心;紅河學(xué)院;中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81760692;81503184) 2016云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目共同資助
【分類號(hào)】：Q943.2;S567.239

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本文編號(hào)：2539632