【摘要】：【目的】洛蒙真菌素是在洛蒙德鏈霉菌(Streptomyces lomondensis)中生物合成的一種具有廣譜抑菌活性的吩嗪類(lèi)抗生素,但其合成機(jī)理仍不清晰。在洛蒙德鏈霉菌S015的洛蒙真菌素生物合成核心基因簇下游,有一甲基轉(zhuǎn)移酶基因——lomo3,研究該基因?qū)β迕烧婢厣锖铣傻挠绊��！痉椒ā繉?duì)lomo3基因進(jìn)行無(wú)痕敲除得到基因缺失突變株S015Δlomo3,再過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建回補(bǔ)突變株S015Δlomo3::lomo3,比較兩株突變株與野生型S015的發(fā)酵產(chǎn)物的變化�！窘Y(jié)果】發(fā)現(xiàn)基因缺失菌株S015Δlomo3不能合成洛蒙真菌素,而基因回補(bǔ)菌株S015Δlomo3::lomo3則可恢復(fù)洛蒙真菌素的合成能力�！窘Y(jié)論】甲基轉(zhuǎn)移酶基因lomo3在洛蒙真菌素生物合成過(guò)程中起著重要的作用,但該基因的具體功能還有待深入研究。研究對(duì)于闡明洛蒙真菌素的生物合成途徑具有一定的指導(dǎo)作用。
【圖文】：

提取物5，NaCl10，固體加瓊脂15；MS培養(yǎng)基(g/L)：黃豆餅粉30，加水煮沸后過(guò)濾，加甘露醇20，瓊脂20；2×YT培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨10，氯化鈉5；1.0×105Pa，20min高溫滅菌。YEME培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖4，麥芽提取物10，酵母提取物4；0.68×105Pa高溫滅菌20min。1.1.3菌株和質(zhì)粒：所用菌株及質(zhì)粒信息見(jiàn)表1。1.1.4引物：所用引物及具體信息見(jiàn)表2。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1菌株培養(yǎng)：洛蒙德鏈霉菌S015及其突變株的培養(yǎng)條件為28°C、180r/min。MS培養(yǎng)基用于產(chǎn)孢培養(yǎng)和固體種子培養(yǎng)；YEME培養(yǎng)基用于液體種圖1洛蒙真菌素生物合成基因簇[10]Figure1Biosynthesisgeneclusteroflomofungin[10]表1菌株和質(zhì)粒Table1Strainsandplasmidsusedinthisstudy菌株或質(zhì)粒Strainsandplasmids特點(diǎn)Characteristics來(lái)源ReferenceEscherichiacoliDH5α克隆宿主TranGenBoitechET12567(pUZ8002)接合轉(zhuǎn)移供體菌，KmR，CmRMacNeil等[11]StreptomyceslomondensisS015野生型本實(shí)驗(yàn)室保存S015Δlomo3lomo3基因敲除突變株本實(shí)驗(yàn)室保存S015Δlomo3::lomo3lomo3基因回補(bǔ)菌株，AprR本實(shí)驗(yàn)室保存PlasmidspKC1139大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，溫控型，AprRBierman等[12]pIB139鏈霉菌整合型質(zhì)粒，包含強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*，AprRWilkinson等[13]pMD19-Tvector克隆載體，AmRTaKaRapCC701lomo3基因同源左臂連接在pMD19-T載體上，AmR本實(shí)驗(yàn)室保存pCC702lomo3基因同源右臂連接在pMD19-T載體上，AmR本實(shí)驗(yàn)室保存pCC703lomo3基因左右同源臂拼接在pMD19-T載體上，AmR本實(shí)驗(yàn)室保存pKC1139-lomo3lomo3基因左右同源臂重組連接在pKC1139-T載體上，用于lomo3基因同框缺失，AprR本實(shí)驗(yàn)室保存pCC704lomo3完整

分析[15]：流動(dòng)相為乙腈:0.1%的甲酸水溶液，梯度為：04min，2:8；420min，4:6；2030min，2:8；流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm；采用AgilentTechnologies1260Infinity高效液相色譜儀，250mm×4.6mm的Agilent5μmEclipsePlusC18色譜柱。2結(jié)果與分析2.1lomo3基因敲除和回補(bǔ)2.1.1基因缺失菌株S015Δlomo3的構(gòu)建：甲基轉(zhuǎn)移酶基因lomo3全長(zhǎng)819bp，設(shè)計(jì)的左、右同源臂長(zhǎng)度分別為1.9kb和2.0kb，包含了lomo3基因左端的58bp和右端的188bp，預(yù)期敲除長(zhǎng)度為lomo3中間的573bp序列。擴(kuò)增lomo3基因左、右同源臂，結(jié)果如圖2A所示。用lomo3left-F和lomo3right-R引物驗(yàn)證重組載體pKC1139-lomo3的構(gòu)建結(jié)果，產(chǎn)物大小為左、右同源臂的總長(zhǎng)3.9kb，如圖2B所示，說(shuō)明構(gòu)建成功。用引物lomo3left-F和lomo3right-R檢驗(yàn)基因缺失菌株S015Δlomo3是否構(gòu)建成功：野生株的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為4.5kb，由于lomo3基因的敲除長(zhǎng)度為573bp，突變株的的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為3.9kb，從圖2C可以看出，產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期相符，說(shuō)明基因缺失菌株S015Δlomo3構(gòu)建成功。2.1.2回補(bǔ)株S015Δlomo3::lomo3的構(gòu)建：用引物lomo3-F、lomo3-R擴(kuò)增lomo3完整的基因片段，構(gòu)建整合載體pIB139-lomo3并導(dǎo)入S015Δlomo3中。用引物pIB-F和pIB-R驗(yàn)證回補(bǔ)菌株S015Δlomo3::lomo3的篩選結(jié)果。從圖3可以看出，菌株S015Δlomo3::lomo3的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1.3kb，，與預(yù)期結(jié)果符合，而基因缺失菌株中則沒(méi)有該條圖2突變質(zhì)粒pKC1139-lomo3構(gòu)建及l(fā)omo3基因敲除突變株驗(yàn)證電泳圖譜Figure2ConstructionofpKC1139-lomo3plasmidinvitroandvalidationoflomo3geneknock-outstrain注：M：1kbplusDNAladdermarker.A：1、2：以全基因組為模板，擴(kuò)增lomo3基因左、右同源臂序列.B：1：以pKC1139-lomo3為模板，擴(kuò)增同源臂序
【作者單位】： 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012AA022107) 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20706037) 國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012CB721005)~~
【分類(lèi)號(hào)】：Q936

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