【摘要】：GH45家族纖維素酶因具有較高的脫毛活性而成為了主要的紡織用纖維素酶,被廣泛應(yīng)用于生物拋光和生物石磨洗。然而該家族發(fā)現(xiàn)和表征過性質(zhì)的酶的數(shù)量遠(yuǎn)比其他家族纖維素酶要少,且多數(shù)的酶是從原菌純化得來,產(chǎn)量較低。此外,應(yīng)用效果較好的幾個(gè)GH45家族纖維素酶都已被專利保護(hù),限制了我們的使用。獲得高效的、高產(chǎn)的新型紡織用纖維素酶及其生產(chǎn)菌株是本研究的主要目標(biāo)。本研究通過簡并引物和熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)直接從環(huán)境宏基因組和直接從測(cè)序真菌Neurospora crassa中克隆基因的方法,獲得了兩個(gè)新GH45家族纖維素酶基因nmGH45和ncGH45,并成功在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)。重組蛋白rNMgh45和rNcGH45都是單一條帶,搖瓶水平表達(dá)量分別為660 mg/ml和80 mg/ml;二者均有良好的pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性,以及適用于紡織工業(yè)的最適pH及最適溫度范圍,并有著一定的應(yīng)用效果。水解產(chǎn)物分析表明,rNMgh45與rNcGH45對(duì)多糖的水解產(chǎn)物主要是纖維五糖。多數(shù)金屬離子對(duì)rNMgh45和rNcGH45沒有明顯提高或抑制作用,而SDS有很強(qiáng)的抑制作用。而還原劑DTT和β-巰基乙醇可使對(duì)兩個(gè)酶都有一定促進(jìn)作用。此外rNMgh45有極佳的鹽溶液和離子溶液抗性。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明,在1M NaCl溶液中,rNMgh45無論是分子結(jié)構(gòu)變化的程度,還是分子中各氨基酸的偏移程度都很小。對(duì)紡織品脫毛實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,酶的添加量為10U時(shí),rNMgh45和rNcGH45造成紡織品的減量率分別為1.81%和1.55%。本實(shí)驗(yàn)就rNMgh45酶表達(dá)水平的提高做了一系列研究。首先嘗試突變r(jià)NMgh45中的二硫鍵來提高其活性,然而當(dāng)rNMgh45中的二硫鍵突變后,其酶活性完全喪失,推測(cè)是由于二硫鍵在維持其構(gòu)象方面具有重要作用。其次,研究了共表達(dá)伴侶蛋白對(duì)表達(dá)量的影響。結(jié)果表明,共表達(dá)BiP對(duì)rNMgh45表達(dá)量有20%的提高作用,PDI,HAC1及PDI同BiP的共同表達(dá)對(duì)表達(dá)量無影響或有部分抑制作用。最后,研究了培養(yǎng)條件對(duì)表達(dá)量的影響,結(jié)果表明,1.0%甲醇濃度與0.5%甲醇濃度相比,可使表達(dá)量提高90%;培養(yǎng)基pH及初始接種量則對(duì)表達(dá)量影響不大。同時(shí),本研究選取了四個(gè)已知具有良好應(yīng)用效果的GH45家族紡織酶Egl3,STCE1,MCE1,RCE1,進(jìn)行了密碼子優(yōu)化并在畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)。結(jié)果顯示,四個(gè)經(jīng)密碼子優(yōu)化的GH45家族纖維素酶表達(dá)量均在20 U/ml左右,大部分遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。本文對(duì)GH45家族纖維素酶進(jìn)行了比較深入透徹的研究,發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)具有應(yīng)用潛力的酶,同時(shí)對(duì)影響蛋白表達(dá)水平的多個(gè)因素進(jìn)行了研究,為GH45家族纖維素酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了很好的理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2539579