【摘要】：基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是植物對非生物脅迫適應(yīng)機制的一個重要方面,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)節(jié)下游基因的表達,在建立植物對脅迫適應(yīng)性過程中起到重要作用。DREB是功能多樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子蛋白家族,家族成員在植物響應(yīng)非生物脅迫方面扮演著重要角色。本研究以苜蓿MsDREB1基因為目的基因,分別把MsDREB1克隆到35S啟動子與rd29A啟動子之后,并把兩種載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入大豆基因組中,通過Southern檢測轉(zhuǎn)基因植株。15 d齡的幼苗在200 mmol·L~(-1)NaCl脅迫條件下,用RT-PCR分析基因不同時間的表達差異;并測定葉綠素、丙二醛、H_2O_2、SOD、相對根長及相對地上部分長度。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)MsDREB1基因在兩種啟動子驅(qū)動下均有一定耐鹽能力,但存在差異。在非脅迫下35S啟動子調(diào)控的MsDREB1為超量表達,而rd29A啟動子調(diào)控MsDREB1表達量較低;在鹽脅迫下,rd29A:MsDREB1表達量高于35S:MsDREB1的表達量;MsDREB1超量表達抑制植株正常生長。MsDREB1誘導(dǎo)表達耐鹽性效果更明顯,其植株脯氨酸含量、SOD活性均顯著高于MsDREB1超量表達,而H_2O_2和MDA含量則顯著低于MsDREB1超量表達。結(jié)果說明MsDREB1作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與了植物的滲透調(diào)節(jié),對植物的耐鹽性具有貢獻。該試驗研究兩種啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)MsDREB1基因大豆耐鹽效果,為MsDREB1基因在大豆耐鹽基因工程中的應(yīng)用提供參考。
【圖文】：

畬蠛斕?苜蓿MsDＲEB1基因的誘導(dǎo)表達增強大豆的耐鹽性19表1引物序列Table1Primersequences名稱Name引物序列Primersequence(5'-3')rd29A(F)-P1CGGATCCGCCATAGATGCAATTCAATCAAACTrd29A(Ｒ)-P2GGGTACCCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAGAAGMsDＲEB1(F)-P3CGGTACCACACCATTTTCCACTCTATCCMsDＲEB1(Ｒ)-P4GCTGCAGTTTCCTATTCTACGATCCAAAＲT-qPCＲMsDＲEB1(F)-P5CCCTTTGACGCATCATCACCＲT-qPCＲMsDＲEB1(Ｒ)-P6TTCCTCCCTGCTCGCTTCTTＲT-qPCＲACTIN2(F)-P7TGATGGTGTGAGTCACACTGTACCＲT-qPCＲACTIN2(Ｒ)-P8GGACAATGGATGGGCCAGACTC圖1重組表達載體結(jié)構(gòu)簡圖Fig．1Constructionoftransgenicplantexpressionvector1．4．2轉(zhuǎn)基因MsDＲEB1mＲNAＲT-qPCＲ分析檢測對擴繁后PCＲ與Southernblot顯示陽性植株(處理后)作外源基因表達量分析。以T2代純合體4個轉(zhuǎn)基因株系(rd-1/rd-2、35S-1/35S-2)及對照苗葉片為檢測材料，每個株系檢測3株苗。用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取轉(zhuǎn)基因大豆的葉樣品ＲNA。用紫外分光度計測定260nm/280nm，計算ＲNA的濃度。參照SMAＲTcDNAsynthesisKit說明書合成cDNA第一鏈。qPCＲ在ABI7300實時檢測系統(tǒng)進行檢測。使用試劑為PowerSybrGreenPCＲ試劑(ABI)。用P5、P6和P7、P8(表1)熒光定量PCＲ引物。反應(yīng)體系參考文獻進行［25］。各反應(yīng)均3次重復(fù)，采用相同條件。基因拷貝數(shù)的定量方法采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法［25］。1．4轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性分析選取轉(zhuǎn)基因及對照種子，26℃萌發(fā)，水培至“兩葉一心”時期，轉(zhuǎn)移入200mmol·L－1NaCl處理6，12，24h后用清水洗凈植株，提取ＲNA并通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。qＲT-PCＲ測定基因的表達量。將小苗轉(zhuǎn)移到水培營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)約7d。將轉(zhuǎn)基因和野生型大豆分成2組。一組在新鮮的

20大豆科學(xué)1期圖2大豆轉(zhuǎn)MsDＲEB1基因Southern雜交分析Fig．2SouthernblotanalysisfromtransgeniclineswithexpressionMsDＲEB1genesinsoybean2．2轉(zhuǎn)基因各株系MsDＲEB1表達量分析為比較啟動子調(diào)控目的基因效果，在不同程度的鹽脅迫下，對4個轉(zhuǎn)基因株系(rd-1/rd-2、35S-1/35S-2)PCＲ及Southernblot陽性(圖2)苗Ｒeal-timePCＲ檢測(圖3)。轉(zhuǎn)MsDＲEB1株系外源基因均能表達，但由于啟動子不同，基因表達量存在較大差異。未經(jīng)脅迫誘導(dǎo)，35S啟動子調(diào)控的Ms-DＲEB1為超表達，相對表達量顯著高于rd29A啟動子調(diào)控的MsDＲEB1表達量。經(jīng)不同濃度鹽脅迫處理后，MsDＲEB1表達量均增加，但rd29A啟動子調(diào)控的MsDＲEB1表達量增加明顯高于35S啟動子調(diào)控表達量。由此表明，rd29A誘導(dǎo)啟動子比35S組成型啟動子更有利于在鹽脅迫下調(diào)控基因表達。圖3轉(zhuǎn)基因大豆各株系200mmol·L－1NaCl脅迫處理下不同時間MsDＲEEB1表達變化Fig．3ChangeofMsDＲEEB1genesexpressioninwildtype(WT)，35S-，rd-linesundersaltstresstreatment2．3不同啟動子轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性差異分析選取PCＲ陽性植株，經(jīng)鹽脅迫處理。rd29A啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因大豆長勢明顯好于35S，，主要表現(xiàn)在生根較快，地上部分生長迅速(圖4)。推測CaMV-35S調(diào)控的外源基因持續(xù)超量表達抑制植株生長，與Chen等［27］在大豆中研究結(jié)果相似［27］。轉(zhuǎn)錄因子在組成型強啟動子驅(qū)動下異源超表達，即使在正常生長條件下，也會啟動基因表達。這種錯誤基因表達常造成轉(zhuǎn)基因植株在正常生長條件下株型變異和植株矮�。�8］。*表示相同處理條件下不同轉(zhuǎn)基因株系與對照差異顯著(P＜0．05)。下同。*indicatethesignificantdifferenceat0．05leveloftransgenicplantwithwildtypeinthesamecon-
【作者單位】： 黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院;
【基金】：河南省科技發(fā)展計劃(112300410042)
【分類號】：S565.1

【參考文獻】

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8 屈曉s

本文編號：2533993