【摘要】：真核生物中,DNA甲基化作為表觀遺傳學修飾的重要手段之一,影響了植物的大量生長發(fā)育過程。文章通過生物信息學分析確定番茄中的胞嘧啶甲基轉移酶同源基因(SlMET1)并對其進行進化關系的分析;利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術從番茄cDNA中擴增出胞嘧啶甲基轉移酶同源基因(SlMET1)全長,構建SlMET1與綠色熒光蛋白融合表達載體,通過在煙草瞬時表達系統(tǒng),對其進行亞細胞定位;實時定量PCR分析SlMET1基因在番茄不同組織中的表達模式;同時,構建SlMET1與HA標簽蛋白融合表達載體,通過免疫共沉淀分析其與DDB1的相互關系。研究結果表明:SlMET1基因在番茄各個時期和組織中都有表達,其中,葉片和花中表達量較高,在果實的變色期和紅果時期表達量較低;通過綠色熒光融合蛋白載體的表達,確定SlMET1基因只在番茄細胞核中表達;通過免疫共沉淀分析確定SlMET1和DDB1之間存在相互作用。該研究為研究DDB1以表觀遺傳學的方式調控植物生長發(fā)育過程奠定了理論基礎。
【圖文】：

心１０ｍｉｎ，吸取上清液于一新ＥＰ管中；測定蛋白質量濃度，以等量的蛋白量加入等量標簽抗體；４℃旋轉結合２ｈ；加入ＰｒｏｔｅｉｎＧ親和層析珠子，４℃旋轉結合１ｈ；用裂解液沖洗珠子３次；加入ＳＤＳ上樣緩沖液，煮沸５ｍｉｎ；離心后取上清進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，轉膜并分別用ＨＡ和Ｆｌａｇ抗體進行顯影。２結果與分析２．１ＳｌＭＥＴ１基因的生物信息學分析結果本文根據(jù)已公布的番茄ＳｌＭＥＴ１序列，對其可能的功能結構域進行分析，結果如圖１所示。圖１番茄ＳｌＭＥＴ１基因的生物信息學分析ＳｌＭＥＴ１由５個功能結構域組成，分別為２個胞嘧啶甲基轉移酶結構域（ＤＮＭＴ－ＲＦＤ）、２個與ＤＮＡ甲基化相關的ＢＡＨ結構域和１個胞嘧啶甲基化酶結構域（ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｓｅ），由此可推斷，本文的ＳｌＭＥＴ１為番茄中與ＤＮＡ甲基化相關的甲基轉移酶（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。結合ＧｅｎＢａｎｋ中已公布的包括擬南芥、甜橙、胡蘿卜、巨桉、煙草、胡楊、蓖麻、芝麻、可可、葡萄等在內(nèi)的植物相應序列，使用ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８和ＭＥＧＡ５．０軟件，，依據(jù)鄰位相連法構建進化樹。結果顯示番茄ＭＥＴ１與煙草的親緣關系最近，與擬南芥最遠。２．２ＳｌＭＥＴ１基因擴增及測序分析以野生型番茄ｃＤＮＡ為模板，ＳｌＭＥＴ１－Ｆ和ＳｌＭＥＴ１－Ｒ為引物進行ＰＣＲ擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖１所示，由圖１可知，所得特異性基因片段的大小與預期的ＳｌＭＥＴ１基因一致。通過測序比對證實，該基因片段即為番茄

ｔａｌＸ１．８和ＭＥＧＡ５．０軟件，依據(jù)鄰位相連法構建進化樹。結果顯示番茄ＭＥＴ１與煙草的親緣關系最近，與擬南芥最遠。２．２ＳｌＭＥＴ１基因擴增及測序分析以野生型番茄ｃＤＮＡ為模板，ＳｌＭＥＴ１－Ｆ和ＳｌＭＥＴ１－Ｒ為引物進行ＰＣＲ擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖１所示，由圖１可知，所得特異性基因片段的大小與預期的ＳｌＭＥＴ１基因一致。通過測序比對證實，該基因片段即為番茄中的ＳｌＭＥＴ１基因。Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００圖２ＳｌＭＥＴ１基因的ＰＣＲ擴增２．３綠色熒光蛋白及植物表達載體鑒定利用限制性內(nèi)切酶ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ雙酶切ｐＢ－ＴＥＸ－ＳｌＭＥＴ１－ＨＡ，另外利用ＫｐｎⅠ和ＥｃｏＲⅠ雙酶切ｐＡＲＴ２７－ＳｌＭＥＴ１－ＧＦＰ表達載體，得到預期大小的ＳｌＭＥＴ１基因片段，如圖３所示。從而確定ＳｌＭＥＴ１基因已經(jīng)連接到載體ｐＢＴＥＸ和ｐＡＲＴ２７－ＧＦＰ中。１．ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ雙酶切２．ＫｐｍⅠ和ＥｃｏＲⅠ雙酶切圖３ｐＢＴＥＸ－ＳｌＭＥＴ１載體和ＰＡＲＴ２７－ＳｌＭＥＴ１－ＧＦＰ酶切鑒定圖２．４ＳｌＭＥＴ１基因表達模式分析提取野生型番茄的各個組織（根、莖、葉、花）和不同發(fā)育時期的果皮（授粉后１４、３５ｄ、變色期和成熟期）中的總ＲＮＡ，反轉錄成ｃＤＮＡ后，用實時定量ＰＣＲ的方法測定不同組織中ＳｌＭＥＴ１８３２合肥工業(yè)大學學報（自然科學版）第４０卷
【作者單位】： 合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(31471157)
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 周昂;牛向麗;劉永勝;;獼猴桃AcGLK2a基因過表達載體的構建及在番茄中的遺傳轉化[J];合肥工業(yè)大學學報(自然科學版);2015年02期

2 Josphert N.Kimatu;;DNA cytosine methylation in plant development[J];遺傳學報;2010年01期

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 曹徐綠;唐曉鳳;苗敏;劉永勝;;番茄胞嘧啶甲基轉移酶同源基因SlMET1功能研究[J];合肥工業(yè)大學學報(自然科學版);2017年06期

2 許偉;苗敏;唐曉鳳;劉永勝;;番茄中一個抗病基因功能的研究[J];合肥工業(yè)大學學報(自然科學版);2017年04期

3 吳雷;金周雨;李雨婷;胡薇;;腺嘌呤、腺苷和腺苷酸的拉曼光譜研究[J];黑龍江科技信息;2016年36期

4 梁乃國;程大友;崔杰;代翠紅;;春化基因誘導植物開花分子機制研究進展[J];中國甜菜糖業(yè);2016年04期

5 侯善茹;馮興標;李光偉;陳丹陽;袁瀏歡;劉永勝;;雨生紅球藻農(nóng)桿菌轉化體系的建立[J];合肥工業(yè)大學學報(自然科學版);2016年09期

6 蔡華;趙維萍;葛奇;阮在浩;;Kr1基因在小麥×玉米遠緣雜交中的表達及甲基化變異[J];麥類作物學報;2016年07期

7 劉艷紅;李光偉;劉永勝;;提高番茄品質的番茄去泛素化酶基因AMSH3[J];合肥工業(yè)大學學報(自然科學版);2016年04期

8 吳雷;李菲;金周雨;李雨婷;胡薇;;基于密度泛函理論方法的核酸堿基拉曼光譜研究[J];生物化學與生物物理進展;2016年03期

9 何薇;湯麗麗;張燕清;張偉;楊帆;;高溫脅迫下水稻基因組DNA表觀遺傳變化MSAP分析[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2016年07期

10 胡能兵;隋益虎;舒英杰;何克勤;;高溫脅迫對不同熱敏型辣椒同工酶及DNA甲基化的影響[J];西北植物學報;2016年01期

【二級參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 馮媛媛;李穎楠;侯佩;張景榮;汪松虎;劉永勝;;番茄ARF4基因果實特異RNAi載體的構建及遺傳轉化[J];應用與環(huán)境生物學報;2012年02期

2 劉繼愷;高永峰;牛向麗;劉永勝;;番茄HP1和HP2基因RNA共干涉載體的構建及遺傳轉化[J];應用與環(huán)境生物學報;2009年05期

3 黃持都;胡小松;廖小軍;吳繼紅;;葉綠素研究進展[J];中國食品添加劑;2007年03期

4 孟凡娟;許向陽;李景富;;番茄果實色素含量和表面顏色相關性研究[J];東北農(nóng)業(yè)大學學報;2006年04期

5 張要武;薛俊;金鳳媚;劉仲齊;;番茄果實耐貯性的遺傳分析[J];華北農(nóng)學報;2005年04期

6 楊敏文;快速測定植物葉片葉綠素含量方法的探討[J];光譜實驗室;2002年04期

本文編號：2528236