【摘要】：真核生物中,DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)修飾的重要手段之一,影響了植物的大量生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。文章通過(guò)生物信息學(xué)分析確定番茄中的胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶同源基因(SlMET1)并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系的分析;利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)從番茄cDNA中擴(kuò)增出胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶同源基因(SlMET1)全長(zhǎng),構(gòu)建SlMET1與綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體,通過(guò)在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位;實(shí)時(shí)定量PCR分析SlMET1基因在番茄不同組織中的表達(dá)模式;同時(shí),構(gòu)建SlMET1與HA標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)載體,通過(guò)免疫共沉淀分析其與DDB1的相互關(guān)系。研究結(jié)果表明:SlMET1基因在番茄各個(gè)時(shí)期和組織中都有表達(dá),其中,葉片和花中表達(dá)量較高,在果實(shí)的變色期和紅果時(shí)期表達(dá)量較低;通過(guò)綠色熒光融合蛋白載體的表達(dá),確定SlMET1基因只在番茄細(xì)胞核中表達(dá);通過(guò)免疫共沉淀分析確定SlMET1和DDB1之間存在相互作用。該研究為研究DDB1以表觀遺傳學(xué)的方式調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

心１０ｍｉｎ，吸取上清液于一新ＥＰ管中；測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，以等量的蛋白量加入等量標(biāo)簽抗體；４℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合２ｈ；加入ＰｒｏｔｅｉｎＧ親和層析珠子，４℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合１ｈ；用裂解液沖洗珠子３次；加入ＳＤＳ上樣緩沖液，煮沸５ｍｉｎ；離心后取上清進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，轉(zhuǎn)膜并分別用ＨＡ和Ｆｌａｇ抗體進(jìn)行顯影。２結(jié)果與分析２．１ＳｌＭＥＴ１基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果本文根據(jù)已公布的番茄ＳｌＭＥＴ１序列，對(duì)其可能的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果如圖１所示。圖１番茄ＳｌＭＥＴ１基因的生物信息學(xué)分析ＳｌＭＥＴ１由５個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成，分別為２個(gè)胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（ＤＮＭＴ－ＲＦＤ）、２個(gè)與ＤＮＡ甲基化相關(guān)的ＢＡＨ結(jié)構(gòu)域和１個(gè)胞嘧啶甲基化酶結(jié)構(gòu)域（ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｓｅ），由此可推斷，本文的ＳｌＭＥＴ１為番茄中與ＤＮＡ甲基化相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。結(jié)合ＧｅｎＢａｎｋ中已公布的包括擬南芥、甜橙、胡蘿卜、巨桉、煙草、胡楊、蓖麻、芝麻、可可、葡萄等在內(nèi)的植物相應(yīng)序列，使用ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８和ＭＥＧＡ５．０軟件，，依據(jù)鄰位相連法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示番茄ＭＥＴ１與煙草的親緣關(guān)系最近，與擬南芥最遠(yuǎn)。２．２ＳｌＭＥＴ１基因擴(kuò)增及測(cè)序分析以野生型番茄ｃＤＮＡ為模板，ＳｌＭＥＴ１－Ｆ和ＳｌＭＥＴ１－Ｒ為引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖１所示，由圖１可知，所得特異性基因片段的大小與預(yù)期的ＳｌＭＥＴ１基因一致。通過(guò)測(cè)序比對(duì)證實(shí)，該基因片段即為番茄

ｔａｌＸ１．８和ＭＥＧＡ５．０軟件，依據(jù)鄰位相連法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示番茄ＭＥＴ１與煙草的親緣關(guān)系最近，與擬南芥最遠(yuǎn)。２．２ＳｌＭＥＴ１基因擴(kuò)增及測(cè)序分析以野生型番茄ｃＤＮＡ為模板，ＳｌＭＥＴ１－Ｆ和ＳｌＭＥＴ１－Ｒ為引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖１所示，由圖１可知，所得特異性基因片段的大小與預(yù)期的ＳｌＭＥＴ１基因一致。通過(guò)測(cè)序比對(duì)證實(shí)，該基因片段即為番茄中的ＳｌＭＥＴ１基因。Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００圖２ＳｌＭＥＴ１基因的ＰＣＲ擴(kuò)增２．３綠色熒光蛋白及植物表達(dá)載體鑒定利用限制性內(nèi)切酶ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ雙酶切ｐＢ－ＴＥＸ－ＳｌＭＥＴ１－ＨＡ，另外利用ＫｐｎⅠ和ＥｃｏＲⅠ雙酶切ｐＡＲＴ２７－ＳｌＭＥＴ１－ＧＦＰ表達(dá)載體，得到預(yù)期大小的ＳｌＭＥＴ１基因片段，如圖３所示。從而確定ＳｌＭＥＴ１基因已經(jīng)連接到載體ｐＢＴＥＸ和ｐＡＲＴ２７－ＧＦＰ中。１．ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ雙酶切２．ＫｐｍⅠ和ＥｃｏＲⅠ雙酶切圖３ｐＢＴＥＸ－ＳｌＭＥＴ１載體和ＰＡＲＴ２７－ＳｌＭＥＴ１－ＧＦＰ酶切鑒定圖２．４ＳｌＭＥＴ１基因表達(dá)模式分析提取野生型番茄的各個(gè)組織（根、莖、葉、花）和不同發(fā)育時(shí)期的果皮（授粉后１４、３５ｄ、變色期和成熟期）中的總ＲＮＡ，反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后，用實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ的方法測(cè)定不同組織中ＳｌＭＥＴ１８３２合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）第４０卷
【作者單位】： 合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471157)
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2528236