【摘要】：【目的】絲狀真菌里氏木霉是纖維素酶生產(chǎn)的主要工業(yè)真菌。纖維素酶分泌過(guò)程中的蛋白運(yùn)輸途徑是控制大量纖維素酶成功輸出的重要環(huán)節(jié),因此,研究蛋白分泌途徑的特定靶標(biāo)基因功能將有助于鑒定纖維素酶運(yùn)輸分泌過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究借助基因敲除方法將里氏木霉液泡蛋白分選相關(guān)基因VPS13缺失,分析了該基因缺失對(duì)菌株生長(zhǎng)、生孢尤其是纖維素酶分泌的影響。【方法】利用Double-joint PCR技術(shù)和同源重組策略構(gòu)建里氏木霉VPS13基因缺失突變株,通過(guò)菌絲培養(yǎng)、顯微觀察、生孢檢測(cè)、蛋白與酶活測(cè)定,系統(tǒng)比較VPS13基因敲除前后菌株的生長(zhǎng)特征、菌絲形態(tài)、孢子形成、蛋白分泌以及纖維素酶活等�！窘Y(jié)果】成功獲得兩株VPS13基因缺失株。與出發(fā)菌株相比,該基因突變后菌絲蔓延速率明顯減慢,但菌體生物量在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后顯著增多。通過(guò)顯微觀察,發(fā)現(xiàn)該基因缺失株菌絲更加密集,分支明顯增多。此外,該基因缺失也導(dǎo)致菌株生孢延遲。纖維素底物平板分析發(fā)現(xiàn)VPS13基因缺失株菌落周圍透明圈更加清晰,且透明圈圈徑比是出發(fā)菌株的4倍,說(shuō)明降解纖維素的能力有明顯提高。進(jìn)一步的液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該基因缺失導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量及纖維素酶活力分別提高16.4%和21.9%�！窘Y(jié)論】里氏木霉VPS13基因在菌絲生長(zhǎng)、生孢、蛋白分泌等不同生物學(xué)過(guò)程中具有功能多樣性,且該基因在菌種改良上可以作為提高纖維素酶產(chǎn)量的重要靶點(diǎn)。
【圖文】：

死愱P(guān)S13A蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPS13蛋白均含有3個(gè)功能保守的結(jié)構(gòu)域：Chorein_N(Chorein或者VPS13N端區(qū)域；pfam12624)、SHR-BD(液泡分選相關(guān)蛋白13SHR結(jié)合區(qū)域；pfam06650)和ATG_C(自噬相關(guān)蛋白C端結(jié)構(gòu)域；pfam09333)(圖1-B)。綜上，VPS13基因在真核生物中是高度保守的，且該基因在真核細(xì)胞中可能具有重要功能。2.2里氏木霉VPS13菌株構(gòu)建及PCR和Southernblot驗(yàn)證參照Double-jointPCR融合技術(shù)[16]，將U-VPS13、pyrG、D-VPS13進(jìn)行3片段融合，使用巢式引物P1/P7擴(kuò)增得到敲除盒，構(gòu)建示意圖如圖2-A。圖1.里氏木霉VPS13蛋白鑒定Figure1.IdentificationofT.reeseiVPS13protein.A:phylogeneticanalysesofVPS13proteinswereperformedusingNeighbourJoiningfromT.reesei(XP_006967068),C.platani(KKF96583),H.marmoreus(KYQ45681),K.phaffii(CCA36675),S.cerevisiae(CAA97491),D.melanogaster(NP_610299)andH.sapiensVPS13A(Q96RL7).Numbersindicatethebootstrapvalue.Thebarmarkerindicatesthegeneticdistance,whichisproportionaltothenumberofaminoacidsubstitutions.B:domainanalysisofVPS13proteinsshowsrelativelyhigherlevelofhomologyintheChorein_N,SHR-BDandATG_CfromT.reesei(XP_006967068),S.cerevisiae(CAA97491),andH.sapiensVPS13A(Q96RL7).分別以里氏木霉QP4基因組DNA和pAB4-1質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增得到的1.90、1.80和2.75kb的VPS13上下游同源臂和pyrG基因片段經(jīng)融合PCR得到6.45kb的VPS13敲除盒。然后采用CaCl2-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化里氏木霉QP4，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行傳代和分純。通過(guò)PCR及Southernblot驗(yàn)證，成功獲得2株驗(yàn)證正確的VPS13基因缺失株，將其命名為VPS13-1和

1560RuiyanLiuetal.|ActaMicrobiologicaSinica,2017,57(10)actamicro@im.ac.cnVPS13-2。驗(yàn)證結(jié)果顯示，VPS13轉(zhuǎn)化子中可以擴(kuò)增得到敲除盒pyrG編碼區(qū)內(nèi)部基因0.79kb(圖2-B)、染色體上游錨定片段2.38kb(圖2-C)和染色體下游錨定片段2.08kb左右的條帶(圖2-D)，而出發(fā)菌株QP4染色體和陰性對(duì)照H2O為模板時(shí)沒(méi)有擴(kuò)展出目的片段條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。這表明VPS13敲除盒已經(jīng)發(fā)生同源交換，成功插入里氏木霉QP4染色體中。進(jìn)而使用VPS13基因內(nèi)部引物(P13/P14)擴(kuò)增0.91kb片段，VPS13轉(zhuǎn)化子和H2O沒(méi)有目的條帶，QP4能擴(kuò)增出0.91kb的目的帶(圖2-E)，說(shuō)明里氏木霉VPS13在染色體水平已經(jīng)被定點(diǎn)敲除。為了進(jìn)一步確認(rèn)VPS13基因敲圖2.里氏木霉VPS13基因缺失菌株構(gòu)建及PCR和Southernblot驗(yàn)證Figure2.ConstructionofVPS13deletioninT.reeseiandidentificationofthemutantsbyPCRandSouthernblot.A:schematicrepresentationofthedeletionofVPS13;B-E:confirmationofVPS13deletionbyPCRamplification;F:confirmationofVPS13deletionbySouthernblot.M:1kbladderDNAmarker;1:PCRproductwithH2Oastemplate;2 4:productsofPCRorSouthernblotwiththegenomicDNAofQP4,VPS13-1andVPS13-2,respectively.
【作者單位】： 齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院;山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(31370135) 山東大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2015JC005) 山東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金(2014-45)~~
【分類號(hào)】：Q93

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10 張曉p

本文編號(hào)：2528195