【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國(guó)最主要的淡水珍珠貝。在珍珠養(yǎng)殖過(guò)程中,外套膜小片移植手術(shù),即插片手術(shù),是十分重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。插片手術(shù)后,經(jīng)過(guò)一系列的免疫反應(yīng),外套膜小片形成珍珠囊,珍珠在珍珠囊里形成。同時(shí),手術(shù)也會(huì)對(duì)育珠貝造成很大的傷害,甚至?xí)驗(yàn)楦腥径劳�。如何采取有效管理措施緩解外套膜小片與育珠貝間免疫排斥反應(yīng),降低插片手術(shù)以后育珠貝受細(xì)菌等病原微生物感染率,成為提高珍珠質(zhì)量和產(chǎn)量的重要課題。目前,外套膜小片移植手術(shù)后,育珠貝和外套膜小片的免疫生理過(guò)程仍不清楚。免疫基因的表達(dá)變化可反映免疫生理過(guò)程,具有指示作用。凝集素是重要的模式識(shí)別受體可識(shí)別多種病原微生物及其他異物,調(diào)控后續(xù)系列免疫反應(yīng)。本研究從三角帆蚌體內(nèi)鑒定出了2個(gè)半乳糖凝集素基因(Galectin),對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了全面而系統(tǒng)的研究,并分析了2個(gè)基因在育珠移植免疫過(guò)程中的指示作用,揭示了生理反應(yīng)關(guān)鍵點(diǎn),以期為育珠生產(chǎn)過(guò)程中及時(shí)采取有效處理措施提供理論依據(jù)。得到了以下研究結(jié)果:1.兩個(gè)半乳糖凝集素基因的cDNA全長(zhǎng)序列的克隆及結(jié)構(gòu)分析我們克隆獲得2個(gè)半乳糖凝集素基因,分別命名為HcGal1和HcGal2。HcGal1基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1917 bp,其中包括140bp的5’端非翻譯區(qū)(UTR),838bp的3’端非翻譯區(qū),以及939 bp的開放閱讀框,編碼了312個(gè)氨基酸。包含2個(gè)CRD。預(yù)測(cè)HcGal1的蛋白分子量和理論等電點(diǎn)分別為35.5kDa和9.54,沒(méi)有信號(hào)肽。HcGal2基因的cDNA序列全長(zhǎng)為797 bp,包括80 bp的5’端UTR,267 bp的3’端UTR,以及450 bp的開放閱讀框,編碼149個(gè)氨基酸。包含1個(gè)CRD。預(yù)測(cè)的蛋白分子量和理論等電點(diǎn)分別為17.2kDa和7.82,沒(méi)有信號(hào)肽。2.兩個(gè)半乳糖凝集素基因組織表達(dá)分析熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),2個(gè)基因的mRNA在三角帆蚌各個(gè)組織中都有表達(dá),其中HcGal1在血細(xì)胞中表達(dá)最高,血液是三角帆蚌重要的免疫組織,而HcGal1基因在血細(xì)胞中的高表達(dá)可以初步推測(cè)其發(fā)揮著重要的免疫作用。HcGal2在外套膜中的表達(dá)量最高,外套膜是貝類免疫的第一道防線,這也表明HcGal2發(fā)揮著重要的免疫作用。Western blot分析表明,2個(gè)基因在蛋白水平的表達(dá)與mRNA的表達(dá)不一致,推測(cè)是由于mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控造成,即機(jī)體會(huì)根據(jù)自身的需要以降解的方式清除不需要表達(dá)的mRNA,或者是通過(guò)改變mRNA的半衰期等來(lái)控制基因表達(dá)的程度以及蛋白產(chǎn)物的生產(chǎn)。3.兩個(gè)半乳糖凝集素基因細(xì)菌誘導(dǎo)后的相應(yīng)表達(dá)2個(gè)基因在血細(xì)胞、外套膜、肝臟經(jīng)革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌刺激后均呈現(xiàn)顯著性上調(diào)的趨勢(shì),表明HcGal1和HcGal2可以起到抑菌、殺菌的作用,從而達(dá)到清除病原菌的目的。并且HcGal1和HcGal2在不同組織中對(duì)于不同細(xì)菌的效應(yīng)時(shí)間有所不同,說(shuō)明HcGal1和HcGal2在不同的組織中對(duì)于每種細(xì)菌的敏感度是有所不同的,原因可能是由于兩個(gè)基因的CRD結(jié)構(gòu)域的不同,使得它們對(duì)不同細(xì)菌表面的糖類的識(shí)別與結(jié)合能力有所不同。4.兩個(gè)半乳糖凝集素基因蛋白水平的功能研究原核表達(dá)出了2個(gè)基因的重組蛋白,細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)顯示2個(gè)基因的蛋白均能夠凝集一些菌種,表明2個(gè)基因均能夠識(shí)別并且抵御病原微生物的入侵。將2個(gè)基因的重組蛋白注射到蚌體后,檢測(cè)血細(xì)胞對(duì)異物的吞噬效率,結(jié)果顯示注射了重組蛋白的血細(xì)胞吞噬效率比對(duì)照組顯著性地增強(qiáng),表明2個(gè)基因的重組蛋白能夠促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬作用,從而殺死病原菌。5.育珠移植免疫生理過(guò)程指示作用研究插片手術(shù)以后,2個(gè)基因在被檢測(cè)的各個(gè)組織中呈現(xiàn)了不同的表達(dá)模式,推測(cè)HcGal2基因?qū)τ凇胺羌骸蔽镔|(zhì)有強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。而HcGal1基因則可能是參與了機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié),通過(guò)降低mRNA水平減小機(jī)體對(duì)異物的排斥而使移植小片不脫落。另外,根據(jù)基因的表達(dá)變化以及對(duì)珍珠囊形成過(guò)程的肉眼觀察,可將插核后移植免疫分為3個(gè)關(guān)鍵生理期,即靜歇期(0-24 h),傷口愈合和珍珠囊形成期(24 h-7 d)和珍珠形成期(7天以后)。通過(guò)基因在這幾個(gè)時(shí)期的表達(dá)變化,可以在我們生產(chǎn)上起到生理指示作用,研究免疫基因的表達(dá)與插片手術(shù)后機(jī)體的生理反應(yīng)之間的關(guān)系,及時(shí)的對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境做出調(diào)整,以降低蚌體的感染率和脫片率,提高成活率和珍珠質(zhì)量。
【圖文】：

16圖 2-1A：三角帆蚌 HcGal1 基因的核苷酸和氨基酸序列。方框里為兩個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，下劃為多聚腺苷酸信號(hào) AATAAA，GenBank 登錄號(hào)為 KX064397。Fig 2-1A: Nucleotide and deduced amino acid sequences of the Hyriopsis cumingii galecPredicted carbohydrate recognition domains are shown as boxes and the predicted polyadenyla

signal AATAAA is underlined. The GenBank accession number of the H. cumingii galectin isKX064397.圖2-1B: SMART軟件分析HcGal1的結(jié)構(gòu)域，包括CRD1（10-155氨基酸殘基）和CRD（2193-311氨基酸殘基）。Fig 2-1B:The predicted conserved carbohydrate recognition domain CRD1 (residues10-155) andCRD2 (residues193-311) of HcGal1 obtained from SMART.HcGal2 基因的 cDNA 序列全長(zhǎng)為 797 bp，包括 80bp 的 5’端 UTR，267 bp 的3’端 UTR，以及 450 bp 的開放閱讀框，編碼 149 個(gè)氨基酸（Genebank 登錄號(hào)：KY404092）。HcGal1 的氨基酸序列中包括 1 個(gè) CRD：氨基酸殘基 9-140。預(yù)測(cè)的蛋白分子量和理論等電點(diǎn)分別為 17.2kDa 和 7.82，，沒(méi)有信號(hào)肽。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2525331