【摘要】：低溫、干旱及高鹽等非生物脅迫嚴重影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量。植物在遭受非生物脅迫后會產(chǎn)生一系列生理生化反應,建立一個系統(tǒng)的防御體系,這一適應過程中許多脅迫響應基因的表達受到調(diào)控。轉錄因子通過調(diào)控下游基因的表達,在植物非生物脅迫的基因表達調(diào)控中發(fā)揮作用。目前已證明參與植物非生物脅迫調(diào)控的轉錄因子包括WRKY、NAC、AP2/ERF及MYB等家族。AP2/ERF家族是植物在環(huán)境脅迫響應中重要的轉錄調(diào)控因子,該家族至少具有一個AP2/ERF結構域,該家族許多基因的表達受非生物脅迫的誘導。轉基因研究表明,許多AP2/ERF基因在植物中過量表達能夠提高轉基因植株對非生物脅迫的抗性。花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物。低溫、干旱和鹽脅迫嚴重影響其生長發(fā)育和產(chǎn)量形成。目前為止,尚缺乏對花生非生物脅迫分子調(diào)控機理的深入研究。本文從花生cDNA文庫中篩選并克隆到6個AP2/ERF家族基因,對這6個基因進行序列分析、組織表達模式分析、非生物脅迫下表達分析等,在此基礎上構建AhERF6基因的超表達載體,并分別轉化擬南芥和花生,通過對轉基因植株抗性分析研究了該基因在植物非生物脅迫調(diào)控中的功能。本研究取得以下結果:1、目的基因篩選、克隆、序列分析及系統(tǒng)進化分析(1)利用BioEdit軟件從花生cDNA文庫中篩選到40個與擬南芥AtCBF1/ DREB1B(UU77378)和AtCBF3/DREB1A (AF074602)氨基酸序列中AP2/ERF結構域相似度較高的序列,表明這些序列可能編碼AP2/ERF家族蛋白。(2)以“花育19號”花生品種為實驗材料,通過RACE和RT-PCR克隆到6個ERF家族轉錄因子基因。氨基酸序列分析表明,這6個基因編碼的蛋白均只包含一個單一的AP2/ERF保守結構域,屬于ERF家族,將這6個基因分別命名為AhERF1、AhERF2、AhERF3、AhERF4、AhERF5和AhERF6。(3)在NCBI網(wǎng)站上通過Blast軟件分析發(fā)現(xiàn),花生中這6個ERF蛋白氨基酸序列與豆科植物的AP2/ ERF轉錄因子氨基酸序列具有較高的同源性,尤其是AP2/ ERF保守結構域中的序列,與擬南芥和豆科植物的DREB/CBF蛋白同源性均達到60%以上。(4)根據(jù)6個ERF家族轉錄因子和擬南芥ERF家族部分成員AP2/ERF保守結構域的氨基酸序列繪制了系統(tǒng)進化樹,結果表明,AhERF2、AhERF3、AhERF5和AhERF6屬于DREB/CBF亞家族,AhERF1和AhERF4屬于ERF亞家族。2、6個ERF轉錄因子基因表達模式分析(1)通過熒光定量PCR分析了這6個ERF家族轉錄因子基因在花生葉片、根、莖、子葉、下胚軸和花中的表達,結果表明6個基因在花生各個組織中均有表達,但表達水平有所不同。(2)對6個基因在非生物脅迫下在花生中的表達模式進行分析,結果表明AhERF4和AhERF6在非生物脅迫下表達量快速明顯的提高,AhERF1和AhERF5的表達在某些脅迫條件下只受到輕微的誘導。還有一些基因在某些脅迫下表達量有所降低:如鹽脅迫花生葉片中AhERF3的表達和干旱脅迫葉片中AhERF2的表達。AhERF3和AhERF5在干旱脅迫的根和葉片中則表現(xiàn)出相反的表達模式。以上結果說明不同基因在花生非生物脅迫調(diào)控中可能具有不同的功能。3、AhERF6在植物非生物脅迫中的功能及分子調(diào)控機理研究(1)對AhERF6編碼蛋白特性進行研究。半乳糖苷酶活性實驗表明,AhERF6蛋白在酵母中具有轉錄激活活性;亞細胞定位分析表明,AhERF6定位于煙草葉片細胞的細胞核中,以上均符合轉錄因子特征。(2)將pCAMBIA1301-AhERF6超表達載體轉入擬南芥中,發(fā)現(xiàn)轉基因植株對低溫和鹽脅迫抗性明顯增強。(3)擬南芥低溫脅迫下的分子機理研究表明,逆境調(diào)控網(wǎng)絡中關鍵基因RD29A、COR15A和KIN1在轉基因擬南芥植株中表達量高于野生型中的表達量,擬南芥內(nèi)源基因DREB1A/CBF3的表達量在轉基因擬南芥植株和野生型中則沒有明顯差異。判斷AhERF6增強轉基因植株對非生物脅迫的抗性可能是通過激活DREB/CBF信號途徑下游基因的表達實現(xiàn)的。
【圖文】：

３．邋１．２．１組織表達模式分析逡逑通過熒光定量ＰＣＲ檢測了在花生中篩選克隆到的６個家族基因在花生葉片、逡逑根、莖、子葉、下胚軸及花中的表達（圖３．３）。３；２五兄Ｆ２和在檢測的６個花逡逑生組織中表達量沒有明顯差異，只在花中略高。在莖中表達量最高，在根中表逡逑達量最低。兄Ｆ３在葉片、根和花中的表達量比在其他組織中高，Ｊ／＾７？Ｆ５在葉片和逡逑根中的表達量高于其他組織。在花中的表達量遠高于根中，約是根中表達量的逡逑６０倍。以上結果說明花生６個五家族基因在檢測的６個花生組織中均有表達但表達逡逑模式不同。逡逑８０．０邐ｐ逡逑！邋｜邋Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ逡逑７０．０邋－邐？邋？邐｜0邋Ｌｅａｆ逡逑｜邋Ｒｏｏｔ逡逑＾邋６０．０邐－邐W 團邋ｓｔｅｍ逡逑５邐WW邋Ｆｌｏｗｅｒ逡逑0邋５０．０邐—邐W 題邋Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ逡逑Ｚ邐W逡逑＾邋４０．０邐－邐＿逡逑＇Ｉ邋３０．０邋－邐＾邐ｒ＊ＴＴ邐W逡逑１邐ｌｌ邋１逡逑２０．０邐－邋ｐ邐■W邋＿逡逑0．0邋ｒＵｉ■S茫櫻琎i一逡逑ＡｈＥＲＦＩ邐ＡｈＥＲＦ２邐ＡｈＥＲＦ３邐ＡｈＥＲＦ４邐ＡｈＥＲＦ５邐ＡｈＥＲＦ６逡逑圖３．３６個基因在花生葉片、根、莖、花、子葉及下胚軸中的組織表達模式分析逡逑葉片、根、莖、子葉及下胚軸均取自三葉期花生幼苗，花取自盛花期花組織。價為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)為三次重復逡逑的平均值，誤差線表示標準誤差ＳＤ。逡逑Ｆｉｇ３．３邋Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＡｈＥＲＦｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅａｖｅｓ

３．１．２．邋４鹽脅迫下的表達模式分析逡逑為進一步了解這６個幻？Ｆ家族轉錄因子基因在花生非生物脅迫中的功能，通過熒光逡逑定量ＰＣＲ檢測了６個基因鹽脅迫下在花生葉片和根中的表達（圖３．７，３．８）。從圖中可逡逑以看出兄Ｆ７在花生根和葉片中在鹽脅迫下表達均略有提高，在處理３邋ｈ后達到最高逡逑（圖３．７ａ，３．８ａ）。的表達沒有明顯規(guī)律，，只在鹽處理１２邋ｈ的花生葉片中（圖逡逑３．７ｂ）和２４ｈ的根中（圖３．８ｂ）表達略有下降。和在花生葉片和根中呈逡逑現(xiàn)不同的鹽脅迫響應模式：鹽脅迫下，在根中的表達沒有明顯變化（圖３．８ｃ），逡逑但在葉片中快速下降（圖３．７ｃ）；鹽脅迫下在葉片中表達量不變（圖３．７ｄ），逡逑在根中則受鹽脅迫快速誘導，鹽處理３邋ｈ表達量到最高，上調(diào)倍數(shù)近１５０倍（圖３．８ｄ）。逡逑３７逡逑
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S565.2;Q943.2

【參考文獻】

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1 ;Functions and Application of the AP2/ERF Transcription Factor Family in Crop Improvement[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年07期

2 Justin W. Walley;Katayoon Dehesh;;Molecular Mechanisms Regulating Rapid Stress Signaling Networks in Arabidopsis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2010年04期

3 張梅;劉煒;畢玉平;王自章;;花生中DREB類轉錄因子PNDREB1的克隆及鑒定[J];作物學報;2009年11期

4 宗自衛(wèi);常陸林;;轉BADH基因花生幼苗抗鹽性研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2009年15期

5 劉旭;李玲;;花生NAC轉錄因子AhNAC2和AhNAC3的克隆及轉錄特征[J];作物學報;2009年03期

6 萬書波;;我國花生產(chǎn)業(yè)面臨的機遇與科技發(fā)展戰(zhàn)略[J];中國農(nóng)業(yè)科技導報;2009年01期

7 ;Transgenic expression of MYB15 confers enhanced sensitivity to abscisic acid and improved drought tolerance in Arabidopsis thaliana[J];遺傳學報;2009年01期

8 楊獻光;梁衛(wèi)紅;齊志廣;馬聞師;沈銀柱;;植物非生物脅迫應答的分子機制[J];麥類作物學報;2006年06期

9 封海勝;花生種子吸脹間耐低溫性鑒定[J];中國油料;1991年01期

10 王晶珊 ,封海勝 ,欒文琪;低溫對花生出苗的影響及耐低溫種質(zhì)的篩選[J];中國油料;1985年03期

本文編號：2523641