【摘要】：低溫、干旱及高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量。植物在遭受非生物脅迫后會(huì)產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng),建立一個(gè)系統(tǒng)的防御體系,這一適應(yīng)過程中許多脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)受到調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達(dá),在植物非生物脅迫的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用。目前已證明參與植物非生物脅迫調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子包括WRKY、NAC、AP2/ERF及MYB等家族。AP2/ERF家族是植物在環(huán)境脅迫響應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,該家族至少具有一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域,該家族許多基因的表達(dá)受非生物脅迫的誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)基因研究表明,許多AP2/ERF基因在植物中過量表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生物脅迫的抗性�；ㄉ俏覈匾挠土献魑锖徒�(jīng)濟(jì)作物。低溫、干旱和鹽脅迫嚴(yán)重影響其生長發(fā)育和產(chǎn)量形成。目前為止,尚缺乏對(duì)花生非生物脅迫分子調(diào)控機(jī)理的深入研究。本文從花生cDNA文庫中篩選并克隆到6個(gè)AP2/ERF家族基因,對(duì)這6個(gè)基因進(jìn)行序列分析、組織表達(dá)模式分析、非生物脅迫下表達(dá)分析等,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建AhERF6基因的超表達(dá)載體,并分別轉(zhuǎn)化擬南芥和花生,通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株抗性分析研究了該基因在植物非生物脅迫調(diào)控中的功能。本研究取得以下結(jié)果:1、目的基因篩選、克隆、序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析(1)利用BioEdit軟件從花生cDNA文庫中篩選到40個(gè)與擬南芥AtCBF1/ DREB1B(UU77378)和AtCBF3/DREB1A (AF074602)氨基酸序列中AP2/ERF結(jié)構(gòu)域相似度較高的序列,表明這些序列可能編碼AP2/ERF家族蛋白。(2)以“花育19號(hào)”花生品種為實(shí)驗(yàn)材料,通過RACE和RT-PCR克隆到6個(gè)ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因。氨基酸序列分析表明,這6個(gè)基因編碼的蛋白均只包含一個(gè)單一的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域,屬于ERF家族,將這6個(gè)基因分別命名為AhERF1、AhERF2、AhERF3、AhERF4、AhERF5和AhERF6。(3)在NCBI網(wǎng)站上通過Blast軟件分析發(fā)現(xiàn),花生中這6個(gè)ERF蛋白氨基酸序列與豆科植物的AP2/ ERF轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列具有較高的同源性,尤其是AP2/ ERF保守結(jié)構(gòu)域中的序列,與擬南芥和豆科植物的DREB/CBF蛋白同源性均達(dá)到60%以上。(4)根據(jù)6個(gè)ERF家族轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥ERF家族部分成員AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果表明,AhERF2、AhERF3、AhERF5和AhERF6屬于DREB/CBF亞家族,AhERF1和AhERF4屬于ERF亞家族。2、6個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)模式分析(1)通過熒光定量PCR分析了這6個(gè)ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因在花生葉片、根、莖、子葉、下胚軸和花中的表達(dá),結(jié)果表明6個(gè)基因在花生各個(gè)組織中均有表達(dá),但表達(dá)水平有所不同。(2)對(duì)6個(gè)基因在非生物脅迫下在花生中的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果表明AhERF4和AhERF6在非生物脅迫下表達(dá)量快速明顯的提高,AhERF1和AhERF5的表達(dá)在某些脅迫條件下只受到輕微的誘導(dǎo)。還有一些基因在某些脅迫下表達(dá)量有所降低:如鹽脅迫花生葉片中AhERF3的表達(dá)和干旱脅迫葉片中AhERF2的表達(dá)。AhERF3和AhERF5在干旱脅迫的根和葉片中則表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。以上結(jié)果說明不同基因在花生非生物脅迫調(diào)控中可能具有不同的功能。3、AhERF6在植物非生物脅迫中的功能及分子調(diào)控機(jī)理研究(1)對(duì)AhERF6編碼蛋白特性進(jìn)行研究。半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)表明,AhERF6蛋白在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性;亞細(xì)胞定位分析表明,AhERF6定位于煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞核中,以上均符合轉(zhuǎn)錄因子特征。(2)將pCAMBIA1301-AhERF6超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫和鹽脅迫抗性明顯增強(qiáng)。(3)擬南芥低溫脅迫下的分子機(jī)理研究表明,逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因RD29A、COR15A和KIN1在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中表達(dá)量高于野生型中的表達(dá)量,擬南芥內(nèi)源基因DREB1A/CBF3的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和野生型中則沒有明顯差異。判斷AhERF6增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生物脅迫的抗性可能是通過激活DREB/CBF信號(hào)途徑下游基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

３．邋１．２．１組織表達(dá)模式分析逡逑通過熒光定量ＰＣＲ檢測了在花生中篩選克隆到的６個(gè)家族基因在花生葉片、逡逑根、莖、子葉、下胚軸及花中的表達(dá)（圖３．３）。３；２五兄Ｆ２和在檢測的６個(gè)花逡逑生組織中表達(dá)量沒有明顯差異，只在花中略高。在莖中表達(dá)量最高，在根中表逡逑達(dá)量最低。兄Ｆ３在葉片、根和花中的表達(dá)量比在其他組織中高，Ｊ／＾７？Ｆ５在葉片和逡逑根中的表達(dá)量高于其他組織。在花中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根中，約是根中表達(dá)量的逡逑６０倍。以上結(jié)果說明花生６個(gè)五家族基因在檢測的６個(gè)花生組織中均有表達(dá)但表達(dá)逡逑模式不同。逡逑８０．０邐ｐ逡逑！邋｜邋Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ逡逑７０．０邋－邐？邋？邐｜0邋Ｌｅａｆ逡逑｜邋Ｒｏｏｔ逡逑＾邋６０．０邐－邐W 團(tuán)邋ｓｔｅｍ逡逑５邐WW邋Ｆｌｏｗｅｒ逡逑0邋５０．０邐—邐W 題邋Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ逡逑Ｚ邐W逡逑＾邋４０．０邐－邐＿逡逑＇Ｉ邋３０．０邋－邐＾邐ｒ＊ＴＴ邐W逡逑１邐ｌｌ邋１逡逑２０．０邐－邋ｐ邐■W邋＿逡逑0．0邋ｒＵｉ■S茫櫻琎i一逡逑ＡｈＥＲＦＩ邐ＡｈＥＲＦ２邐ＡｈＥＲＦ３邐ＡｈＥＲＦ４邐ＡｈＥＲＦ５邐ＡｈＥＲＦ６逡逑圖３．３６個(gè)基因在花生葉片、根、莖、花、子葉及下胚軸中的組織表達(dá)模式分析逡逑葉片、根、莖、子葉及下胚軸均取自三葉期花生幼苗，花取自盛花期花組織。價(jià)為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)為三次重復(fù)逡逑的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤差ＳＤ。逡逑Ｆｉｇ３．３邋Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＡｈＥＲＦｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅａｖｅｓ

３．１．２．邋４鹽脅迫下的表達(dá)模式分析逡逑為進(jìn)一步了解這６個(gè)幻？Ｆ家族轉(zhuǎn)錄因子基因在花生非生物脅迫中的功能，通過熒光逡逑定量ＰＣＲ檢測了６個(gè)基因鹽脅迫下在花生葉片和根中的表達(dá)（圖３．７，３．８）。從圖中可逡逑以看出兄Ｆ７在花生根和葉片中在鹽脅迫下表達(dá)均略有提高，在處理３邋ｈ后達(dá)到最高逡逑（圖３．７ａ，３．８ａ）。的表達(dá)沒有明顯規(guī)律，，只在鹽處理１２邋ｈ的花生葉片中（圖逡逑３．７ｂ）和２４ｈ的根中（圖３．８ｂ）表達(dá)略有下降。和在花生葉片和根中呈逡逑現(xiàn)不同的鹽脅迫響應(yīng)模式：鹽脅迫下，在根中的表達(dá)沒有明顯變化（圖３．８ｃ），逡逑但在葉片中快速下降（圖３．７ｃ）；鹽脅迫下在葉片中表達(dá)量不變（圖３．７ｄ），逡逑在根中則受鹽脅迫快速誘導(dǎo)，鹽處理３邋ｈ表達(dá)量到最高，上調(diào)倍數(shù)近１５０倍（圖３．８ｄ）。逡逑３７逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S565.2;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2523641