發(fā)布時(shí)間：2019-07-12 19:12

【摘要】：抗菌脂肽類化合物主要是芽孢桿菌通過生物合成途徑合成的一類低分子量代謝產(chǎn)物。隨著分子生物學(xué)研究手段的不斷進(jìn)步,人類已經(jīng)逐漸了解并掌握脂肽類化合物生物合成的規(guī)律。大多數(shù)脂肽類化合物的合成都是由非核糖體肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthase,NRPS)基因簇調(diào)控。本研究首先確定脂肽類化合物NRPS生物合成過程的編碼基因,以實(shí)驗(yàn)室保藏的11株枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌以及多粘類芽孢桿菌作為研究對(duì)象,通過分子克隆技術(shù)對(duì)其編碼基因進(jìn)行檢測(cè),并輔以高效液相檢測(cè)(High performance liquid charomatography,HPLC)進(jìn)行驗(yàn)證,從而推測(cè)芽孢桿菌生物合成抗菌脂肽類化合物的潛在能力�；谝陨鲜侄�,我們建立了一種抗菌脂肽產(chǎn)生菌快速識(shí)別、篩選和抗菌脂肽快速鑒定的方法。另一方面,NRPS的模塊化結(jié)構(gòu)和非常規(guī)線性化裝配模式?jīng)Q定了其終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性和活性的豐富性。本研究利用組合生物合成技術(shù),對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株P(guān)lipastatin產(chǎn)生菌Bacillusllubtilis PB2進(jìn)行分子改造,分別對(duì)其具有底物選擇專一性的ppsC-A2結(jié)構(gòu)域、具有完整功能的ppsC-Glu模塊以及獨(dú)立酶活性的ppsC亞基結(jié)構(gòu)進(jìn)行敲除,構(gòu)建NRPS雜合酶系,探索新型脂肽類化合物的形成,并探究結(jié)構(gòu)域、模塊與亞基的缺失對(duì)誘導(dǎo)出現(xiàn)NRPS模塊跳躍現(xiàn)象的影響及相互關(guān)系。然后針對(duì)出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象的ppsC-A2結(jié)構(gòu)域敲除菌株上下游ppsC-C2結(jié)構(gòu)域和ppsC-PCP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行敲除,研究各個(gè)結(jié)構(gòu)域及模塊間的相互作用和聯(lián)系,進(jìn)一步探究脂肽類化合物模塊跳躍現(xiàn)象的出現(xiàn)與復(fù)合酶系調(diào)控生物合成傳遞間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction,PCR)和HPLC檢測(cè)技術(shù)建立了一種抗菌脂肽產(chǎn)生菌快速識(shí)別、篩選方法.通過擴(kuò)增抗菌脂肽類化合物合成酶編碼基因與脂肽類化合物HPLC檢測(cè),證實(shí)了枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌以及多粘類芽孢桿菌均具有多種抗菌脂肽合成酶編碼基因(如sfp、srfAA、srfAD、fenA、fenB、ferD、ituD、ituA、ituB、albF、albA、pmxB、pmxC、pmxE、bmyA、bmyB、bmyC),推測(cè)它們均具有合成多種抗菌脂肽類化合物的潛力(如Surfactin、Fengycin、Iturin、BacillomycinD、SubtilosinA、Polymyxin)。但是某些脂肽類化合物因合成產(chǎn)量過低或合成過程受阻而未被HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其具體原因有待研究。基因檢測(cè)結(jié)果同樣證實(shí)了不同種屬的菌株具有不同或相同的抗菌脂肽類化合物合成酶編碼基因,而同一種細(xì)菌的不同菌株之間具有的抗菌脂肽類化合物合成酶編碼基因也不盡相同。因此,該技術(shù)同樣可以運(yùn)用于尋找不同種屬細(xì)菌之間的同源性基因。2.利用組合生物合成策略構(gòu)建ppsC-A2結(jié)構(gòu)域、ppsC-Glu模塊、ppsC亞基敲除菌株.通過重疊延伸PCR(Splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)獲得敲除位點(diǎn)上、下游基因融合片段,成功構(gòu)建了枯草芽孢桿菌敲除載體。將敲除載體轉(zhuǎn)入B.subtilis.PB2感受態(tài)細(xì)胞中,誘導(dǎo)無(wú)標(biāo)記同源重組敲除,獲得兩步單交換成功的重組敲除菌株。對(duì)敲除菌株進(jìn)行HPLC分析,ppsC-A2結(jié)構(gòu)域敲除菌株P(guān)lipastatin生物合成過程出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象,并在其發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)一種新型抗菌脂肽類似物。經(jīng)高分辨率質(zhì)譜(High-resolution mass spectrometry,HR-ESI-MS)與二級(jí)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry,MS/MS)分析,確定該物質(zhì)為缺少第六模塊丙氨酸(Alanine,Ala)的Plipastatin線性類似物。ppsC-Glu模塊敲除菌株和ppsC亞基敲除菌株P(guān)lipastatin合成過程受阻,合成釋放Plipastatin能力明顯下降。同時(shí)兩株重組菌株未出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象,未發(fā)現(xiàn)有新型抗菌脂肽類化合物產(chǎn)生。3.利用無(wú)標(biāo)記同源重組方法構(gòu)建ppsC-C2結(jié)構(gòu)域和ppsC-PCP2結(jié)構(gòu)域敲除菌株.ppsC-PCP2結(jié)構(gòu)域敲除菌株HPLC檢測(cè)出現(xiàn)與ppsC-A2結(jié)構(gòu)域敲除菌株相似峰型,出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象,合成了同樣的缺少第六模塊Ala的Plipastatin類似物。而ppsC-C2結(jié)構(gòu)域敲除菌株P(guān)lipastatin合成過程受阻,無(wú)任何產(chǎn)物合成,未出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象。說明模塊跳躍現(xiàn)象的出現(xiàn)主要與A結(jié)構(gòu)域和PCP結(jié)構(gòu)域有關(guān)。
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圖片說明： 的肽單體酶。而＾４Ｚ）基因與脂肽鏈的內(nèi)酯化相關(guān)。逡逑１．２邐Ｆｅｎｇｙｃｉｎ／Ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ邋合成機(jī)理逡逑編碼Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成的調(diào)控基因由知？操縱子組成１２９１（圖１－１），包括逡逑聲和知？５邋５個(gè)基因，它們分別控制合成編碼Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶的５個(gè)單體酶。Ｆｅｎｇｙｃｉｎ逡逑合成酶一共包括１０個(gè)模塊，每個(gè)模塊單獨(dú)活化一種氨基酸，這些氨基酸依次連接成完逡逑整的脂肽鏈。Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成過程由ＦｅｎＣ^u始，經(jīng)ＦｅｎＤ、ＦｅｎＥ、ＦｅｎＡ的傳遞，最終由逡逑ＦｅｎＢ的ＴＥ結(jié)構(gòu)域終止合成，，釋放完整肽鏈。而Ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ是由５．邐１６８菌株產(chǎn)生逡逑的一類與Ｆｅｎｇｙｃｉｎ結(jié)構(gòu)性質(zhì)十分相似的抗菌脂肽類物質(zhì)，其操縱子合成機(jī)制與片／７操縱逡逑子類似［３１，３２］。逡逑￣Ｆ邐？邐ｐｐ邐ｐｐ邐ｐｐｐ邐ｐ逡逑Ｃｌ邋Ａｔ邋ｃ邋Ｃ２邐Ａ２邐：邋Ｅ邐Ｃｌ邋Ａｌ邐ｃ邋＾邋Ａ２邋ｃ邐Ｅ邋Ｃｌ邋Ａｌ邐ｃ邋＾邋Ａ２邋ｃ邋Ｅ邐Ｃｌ邐Ａｌ邋Ｃ邋Ｃ２邋Ａ２邋Ｃ邋0邋Ａ３邋Ｃ邐Ｅ邋Ｃｌ邐Ａｌ邋Ｃ邐ｐｇ逡逑ＰＩ邐＞２邐Ｐ１邐Ｐ：邐Ｐｉ邐Ｐ２邐ＰＩ邋Ｐ７邋Ｐ３邐Ｐｉ逡逑塊塊塊０l(fā)捒榭椋犢欏峰義希牽歟蹂澹希椋椋殄危裕埽蟈危裕歟簦駑危澹牽瑁殄澹粒歟徨澹鄭幔戾危校潁镥澹牽歟椋殄澹裕埽蟈危桑簦翦義稀擔(dān)穡穡螅粒剩瑁椋緬危掊澹穡穡簦洛澹媯澹睿膩濉怠擔(dān)浚茫媯ⅰ赍巍峰沃埃皚0邋—〉逡逑圖１－１邋／ｅ？操縱子與操縱子合成機(jī)制逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏｒｇａｎｉｚａｎｔｉｏｎ邋ｏｆｆｅｎ邋ｏｐｅｒｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｐｓ邋ｏｐｅｒｏｎ逡逑１．３邐Ｉｔｕｒｉｎ合成機(jī)理逡逑根據(jù)前人的報(bào)道［３３］
文內(nèi)圖片：
圖片說明： ３．４ＮＲＰＳ線性催化的裝配模式?jīng)Q定了模塊與氨基酸殘基之間線性對(duì)應(yīng)的關(guān)系。對(duì)ＮＲＰＳ模塊化結(jié)構(gòu)進(jìn)行敲除，其最終脂肽類化合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的在研究過程中，通常通過同源重組技術(shù)對(duì)ＮＲＰＳ途徑中特定的結(jié)構(gòu)域或模塊進(jìn)行首先需要構(gòu)建含待敲除區(qū)域上下游序列的特定敲除質(zhì)粒，然后將敲除質(zhì)粒導(dǎo)入株中，與原始菌株基因組發(fā)生同源雙交換，上下游間敲除位點(diǎn)的序列將被完全從而使ＮＲＰＳ失去敲除基因的功能，導(dǎo)致其無(wú)法參與ＮＲＰＳ合成途徑合成正常的謝產(chǎn)物，終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域功能因此而發(fā)生變化。逡逑Ｍｏｏｔｚ等人對(duì)Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ合成酶基因簇第２模塊進(jìn)行敲除，敲除菌株可以合成置氨基酸缺失的衍生物（圖１－３），但是產(chǎn)量較原始菌株大大下降［１￣。在對(duì)ＹＭ－２１６３９１的基因簇異源表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，敲除其負(fù)調(diào)控基因的突變基因表達(dá)株產(chǎn)量提高了邋２０倍［１（）２］。近年來(lái)，在對(duì)他克莫司基因敲除回補(bǔ)研究中得到多因敲除突變株［１（）３］，獲得多種活性大小不一的他克莫司類似物。此外，還可以在掉ＮＲＰＳ某些功能模塊的基礎(chǔ)上插入異源模塊進(jìn)行表達(dá)，也可以獲得新型脂肽物。比如前文所述的達(dá)托霉素在敲除辦／Ｄ編碼基因后，插入其它脂肽類化合物的進(jìn)行表達(dá)，得到了達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)類似物［９４，１（）４］。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2513919