【摘要】：研究目的1.檢測BALB/c小鼠脾臟基質(zhì)的增齡性變化,探討β-catenin信號分子在脾臟基質(zhì)老化中的作用。2.檢測BALB/c小鼠脾臟B淋巴細胞比例、B淋巴細胞亞群比例和增殖、凋亡、周期相關(guān)基因mRNA表達水平的增齡性變化,探討基質(zhì)老化對B細胞老化的影響。3.探索C57BL/6J小鼠來源的同種異基因骨髓間充質(zhì)干細胞移植對BALB/c、鼠脾臟基質(zhì)和B細胞老化的影響。方法1.將雌性BALB/c小鼠分別按照2-4月齡、8-10月齡和18-20月齡定義為青年組、中年組和老年組。蘇木精-伊紅染色觀察不同年齡組小鼠脾臟的組織學(xué)特征；天狼星紅染色檢測脾臟中膠原分布情況；免疫組織化學(xué)法檢測脾臟collagen I、 elasti、fibronectin的蛋白表達情況。2.實時熒光定量PCR (Real-time PCR)法檢測不同年齡組BALB/c小鼠脾臟基質(zhì)成分agrin、college Iα1、collegen Ⅲα1 collegen Ⅳα1、collegen Ⅵα1、elastin、 fibrillin1、fibronectin 1、fibulin1、lamininα5、MMP-2的mRNA表達水平,p-catenin信號分子及其上游調(diào)控子DVL2、 DVL3、CK1、GSK-3β,下游轉(zhuǎn)錄子TCF4,靶基因PPARδ、 Axin2、c-myc、cyclinD1的mRNA相對表達量,蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測P-catenin和CK1的蛋白表達情況,Real-time PCR法檢測B細胞標記CD19的mRNA相對表達量。3.制備脾臟單細胞懸液,流式細胞術(shù)檢測不同年齡組BALB/c小鼠脾臟CD19+B淋巴細胞比例及B細胞中CD19+CD5+、CD19+CD24+、CD19+IgM+IgD-和CD19+IgD+細胞亞群的比例。4.流式細胞術(shù)分選、收集脾臟B淋巴細胞,Real-time PCR法檢測B細胞中增殖相關(guān)基因Ki-67,凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase8,細胞周期相關(guān)基因cyclinD1、cyclinE1、p16INK4a,抗原決定簇分子CD5、CD24, β-catenin信號分子及其上游調(diào)控子DVL2、DVL3、CK1、GSK-3β,下游轉(zhuǎn)錄子TCF4,靶基因Axinδ、Axin2、c-myc的mRNA相對表達量。5.骨片消化法分離、培養(yǎng)C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)。6.通過尾靜脈向?qū)嶒灲M小鼠體內(nèi)注射BMSCs,每2周注射一次,連續(xù)注射4次,單次注射量1x106個細胞(懸于100 μl PBS),末次注射后2周取材,重復(fù)檢測上述脾臟基質(zhì)和B細胞老化相關(guān)指標的變化。結(jié)果第一部分1.老年組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)紊亂,含鐵血黃素顆粒和I型膠原沉積較青年組增加。2.老年組小鼠脾臟基質(zhì)成分agrin、collagen Iα1、collagen Ⅲα1、collagen Ⅳα1、elastin和fibrillin 1的mRNA相對表達量顯著低于青年組小鼠(P0.01或P0.05)；collagen Ⅵα1、fibronectin 1、fibulin 1、laminin α5和MMP2的mRNA相對表達量與青年組小鼠無統(tǒng)計學(xué)差異。3.老年組小鼠脾臟β-catenin信號分子及其上游調(diào)控子CK1的mRNA和蛋白表達水平均低于青年組(P0.05或P0.01),下游靶基因PPARδ、cyclin D1、CD44的mRNA表達水平顯著低于青年組(P0.01或P0.05)；其他調(diào)控子DVL2、DVL3、GSK-3β,下游轉(zhuǎn)錄子TCF4,靶基因Axin2的mRNA相對表達量均值低于青年組,但未達到統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4.經(jīng)過4次C57BL/6J小鼠來源的同種異基因BMSCs移植后,老年組BALB/c小鼠脾臟基質(zhì)成分collagen Ⅲα1的mRNA表達顯著上調(diào)(P0.01), collagen Ⅳα1和fibronectin 1的mRNA表達下調(diào)(P0.05和P0.01); β-catenin信號分子的下游轉(zhuǎn)錄子TCF4和靶基因CD44 mRNA表達上調(diào)(P0.05),其余相關(guān)基因表達無明顯變化。第二部分1.不同年齡組BALB/c小鼠脾臟中B淋巴細胞比例無顯著差異,老年組小鼠脾臟B細胞中CD19+CD5+、CD19+IgD+細胞亞群比例顯著高于青年組(P0.01),CD19+CD24+、CD19+IgM+IgD'細胞亞群比例顯著低于青年組(P0.01)。老年組脾臟B細胞中CD24、Ki-67的mRNA表達水平顯著低于青年組(P0.01),CD5、Bcl-2、caspase 8和p16INK4a的mRNA表達水平顯著高于青年組(P0.05或P0.01), Bax、caspase 3、cyclinD1和cyclinE1的mRNA表達水平與青年組無統(tǒng)計學(xué)差異。2.不同年齡組BALB/c小鼠脾臟B細胞中β-catenin信號分子及其上游調(diào)控子DVL2、DVL3、CK1,下游靶基因PPARδ、CD44、Axin2的mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異。3.經(jīng)過4次C57BL/6J小鼠來源的同種異基因BMSCs移植后,老年組小鼠脾臟B細胞比例和CD19的mRNA表達水平顯著升高(P0.01)；B細胞中CD19+CD5+、 CD19+CD24+和CD19+IgD+亞群比例顯著降低(P0.01或P0.05)；Ki-67和p16INK4a的mRNA表達水平上調(diào)(P0.01), CD5、CD24和Caspase 8的mRNA表達水平下調(diào)(P0.05),其余基因表達無明顯變化。結(jié)論1.小鼠脾臟基質(zhì)老化表現(xiàn)為多種細胞外基質(zhì)成分的mRNA表達水平下調(diào)。2. β-catenin信號分子對脾臟基質(zhì)老化有重要作用。3.隨著年齡增加,小鼠脾臟B淋巴細胞比例維持穩(wěn)定,但增殖活性降低,部分亞群比例發(fā)生改變,可能與基質(zhì)老化有關(guān)。4.同種異基因骨髓間充質(zhì)干細胞移植可以影響部分老化相關(guān)的脾臟基質(zhì)和B細胞改變。
[Abstract]:Study objective 1. To investigate the age-related changes of the spleen matrix in BALB/ c mice, and to explore the role of the antigen-cattenin signal in the aging of the spleen matrix. The changes of B-lymphocyte proportion, B-lymphocyte subpopulation ratio and proliferation, apoptosis and cycle-related gene mRNA expression level in BALB/ c mice were detected, and the effect of matrix aging on the aging of B cells was discussed. To explore the effects of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cell transplantation from C57BL/ 6J mice on the aging of BALB/ c, murine spleen and B cells. Method 1. The female BALB/ c mice were defined as the youth group, middle-aged group and old group according to the age of 2-4 months,8-10 months and 18-20 months, respectively. The histological characteristics of the spleen of mice with different age groups were observed by hematoxylin-eosin staining. The distribution of collagen in the spleen was detected by the red staining of Sirius. The expression of agrin, college I-1, collegen 鈪，

本文編號：2507671