【摘要】：第一部分先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)特點(diǎn)小結(jié)目的:研究BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、CR、GDNF、NSE、S-100、CAD、Bcl-2等幾種神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物在先天性無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(HSCR)的表達(dá)特點(diǎn),并探討它們與先天性無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(HSCR)的病因相關(guān)性及臨床診斷意義。方法:采用免疫組織化學(xué)法檢測BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、CR、GDNF、NSE、S-100、CAD、Bcl-2等幾種神經(jīng)標(biāo)志物在45例HSCR(HSCR正常段、擴(kuò)張段組、痙攣段組)、10例先天性巨結(jié)腸類源病(HAD)和10例對照組結(jié)腸壁的表達(dá),并與常規(guī)HE染色進(jìn)行對比分析。結(jié)果:HE染色擴(kuò)張段腸壁神經(jīng)叢中可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,痙攣段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失;所有標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)染色與HE染色診斷結(jié)果一致。50%~70%的病例陽性表達(dá)BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、GDNF等,90%以上病例表達(dá)CR、NSE、S-100、CAD等陽性,Bcl-2在正常對照組和發(fā)育較好的HSCR病例中不表達(dá),在新生兒HSCR和巨結(jié)腸類緣病中表達(dá)陽性。結(jié)論:1)GDNF、BMP2、BMP 4、Ret、CXCR4等標(biāo)志物通過激活不同的信號途徑參與腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,與部分HSCR的病因有關(guān);2)Bcl-2只在發(fā)育不成熟的神經(jīng)嵴細(xì)胞表達(dá),可用于鑒別HSCR和HAD;3)CR、S-100和CAD聯(lián)合免疫組化檢查對HSCR的臨床診斷價值較高,聯(lián)合運(yùn)用這些指標(biāo),對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)纖維呈互補(bǔ)性陽性顯色,可以增加診斷的準(zhǔn)確性。第二部分兒童先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的基因芯片檢測及相關(guān)基因篩選目的:研究先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒直結(jié)腸病變段(痙攣段)的全人類基因表達(dá)譜檢測方法及結(jié)果分析,初步篩查小兒先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的差異表達(dá)基因。方法:應(yīng)用全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對6例先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒直結(jié)腸病變段(痙攣段)和3例正常結(jié)腸組織進(jìn)行全人類基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測,根據(jù)檢測結(jié)果所提供的火山圖(Volcano Plots)、盒狀圖(Box Plot)、散點(diǎn)圖(Scatter Plot)、聚類圖(Heat Map and Hierarchical Clustering)、P值(P-value)、絕對差異倍數(shù)(Absolute Fold change)等方法分析所得結(jié)果,初步篩選出對小兒先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥有意義的差異表達(dá)基因,為下一步進(jìn)行結(jié)果驗證及分析研究篩選出目標(biāo)基因。結(jié)果:在檢測到的20000多個人類基因中,初步篩選出上調(diào)的差異表達(dá)基因共3850個,P-value值均0.05,差異倍數(shù)均2倍,P-value值0.01~0.05共154個,0.001~0.009之間共468個,0.0001~0.0009之間共834個,P-value值0.0001共2394個基因;下調(diào)的差異表達(dá)基因共645個,P-value值均0.05,差異倍數(shù)均2倍,P值0.01~0.05共52個,0.001~0.009之間共111個,0.0001~0.0009之間共142個,P-value值0.0001共321個基因。上調(diào)的與經(jīng)典信號通道有關(guān)的基因共118個,P-value值0.01,0.01~0.0001共48個,差異倍數(shù)均2倍;P-value值0.0001共70個,差異倍數(shù)均2倍;下調(diào)的與經(jīng)典信號通道有關(guān)的基因共11個,P-value值均0.001,差異倍數(shù)均2倍。結(jié)論:1)先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)生病因非常復(fù)雜,常涉及多基因改變。2)基因表達(dá)譜芯片技術(shù)可同時產(chǎn)生大量的表達(dá)基因數(shù)據(jù),利用多種技術(shù)對芯片產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,可為先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)病機(jī)理的研究提供一個全新的目標(biāo)和方向,是一種快捷高效的研究手段。第三部分先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織中WNT5a、GLI-1、BMP7的表達(dá)特點(diǎn)研究目的:研究WNT5a、GLI-1、BMP7在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒正常段(吻合口)、擴(kuò)張段、痙攣段中的表達(dá)和分布特點(diǎn),驗證芯片結(jié)果,并與正常結(jié)腸組織進(jìn)行比較,探討它們與先天性無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(HSCR)的病因相關(guān)性及分子生物學(xué)意義。方法:收集本院確診為先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的患兒手術(shù)時切除的結(jié)腸組織75例,外傷等非先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒的正常結(jié)腸組織10例;采用免疫組織化學(xué)方法檢測WNT5a、GLI-1、BMP7在75例HSCR(正常段、擴(kuò)張段、痙攣段)和10例正常對照組的結(jié)腸壁的表達(dá)情況,并與常規(guī)HE染色進(jìn)行對比分析;Western blotting檢測WNT5a、GLI-1、BMP7蛋白在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織不同部位的表達(dá)水平;q RT-PCR檢測WNT5am RNA、GLI-1m RNA、BMP7 m RNA在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織不同部位的表達(dá)水平;結(jié)果:1)HE染色,正常結(jié)腸和先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的正常段、擴(kuò)張段腸壁神經(jīng)叢中可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,而病變的痙攣段則神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失。2)免疫組織化學(xué)方法檢測顯示,在有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的正常結(jié)腸組織和先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織正常段、擴(kuò)張段,WNT5a、GLI-1、BMP7均有表達(dá)。在缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的痙攣段,WNT5a、GLI-1、BMP7無明顯表達(dá)。3)Western blotting檢測顯示,先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥結(jié)腸組織的痙攣段WNT5a、GLI-1、BMP7蛋白表達(dá)水平顯著低于擴(kuò)張段和正常段(P㩳0.01,n=75);4)q RT-PCR檢測顯示,先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織痙攣段WNT5am RNA、GLI-1m RNA、BMP7 m RNA顯著低于擴(kuò)張段和正常段(P㩳0.01,n=75),而擴(kuò)張段與正常段兩組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P㧐0.05,n=75);結(jié)論:1)WNT5a、GLI-1、BMP7在先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥患兒結(jié)腸組織的正常段和擴(kuò)張段中具有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的部位表達(dá),在病變的痙攣段中由于缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞而表達(dá)水平顯著降低。2)結(jié)果與基因芯片相吻合。3)這種表達(dá)的差異性可能與WNT5a、GLI-1、BMP7作為發(fā)育相關(guān)基因參與了先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥的發(fā)病有關(guān),具體的分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。第四部分跨胎盤RNAi技術(shù)研究WNT5A質(zhì)粒在小鼠腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)生過程中的作用機(jī)制研究目的:構(gòu)建表達(dá)WNT5a基因RNA干擾片段的質(zhì)粒,在Balb/C小鼠懷孕后不同時間窗(E8.5-E14.5)通過孕鼠尾靜脈注射一定量的RNAi質(zhì)粒下調(diào)WNT5a基因表達(dá)。研究Balb/C小鼠胚胎發(fā)育不同時期(E8.5-E14.5)WNT5a在腸道組織表達(dá)水平的變化特點(diǎn)和表達(dá)定位情況,探討WNT5a對胎鼠消化道發(fā)育表現(xiàn)型的影響、在小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用及其與先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)病的相關(guān)性。方法:1)采用DNA重組技術(shù)將靶向的WNT5a基因的RNA干擾片段定向克隆到載體pc DNA6.2?-GW/Em GFP-mi R(Life,Catalog no.K4936-00)上,構(gòu)建含有表達(dá)WNT5a基因的質(zhì)粒,經(jīng)過擴(kuò)增、測序并驗證;2)從胎腸開始發(fā)育的孕第8.5天起,在不同的時間點(diǎn)、以不同的濃度、注射體積、注射速度(注射時間)通過尾靜脈向妊娠的Balb/C小鼠體內(nèi)注射WNT5a基因RNA干擾質(zhì)粒,下調(diào)WNT5a基因表達(dá),獲得靶基因WNT5a表達(dá)水平下調(diào)的子鼠;3)取注射質(zhì)粒后48h胚胎和出生后2天小鼠處死,解剖取出整個消化道(從胃到直腸),分段(前腸、中腸、后腸)制備冰凍切片,免疫組化檢測WNT5s及其下游基因的表達(dá)情況及腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育情況,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況;利用q RT-PCR檢測WNT5s及其下游基因m RNA的表達(dá)情況;利用Western-blot檢測WNT5s及其下游基因蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1)成功構(gòu)建表達(dá)WNT5a基因RNA干擾片段的穿梭質(zhì)粒pc DNA6.2?-WNT5a 1、2、3、4以及陰性對照質(zhì)粒pc DNA6.2?-scrambled,測序驗證得出重組克隆中插入的片段序列與設(shè)計的寡聚單鏈DNA序列是一致的;2)妊娠Balb/C小鼠尾靜脈注射WNT5a質(zhì)粒后可以通過胎盤屏障,有效下調(diào)WNT5a基因在腸道組織表達(dá);轉(zhuǎn)染效果受質(zhì)粒濃度、注射體積、注射速度(注射時間)以及孕鼠體重等影響;3)免疫組化檢測顯示干擾后子鼠后腸發(fā)育不良,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失;q RT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)NT5a m RNA在前腸和中腸的表達(dá)水平較后腸顯著增高;Western-blot結(jié)果顯示W(wǎng)NT5a蛋白的表達(dá)情況與q RT-PCR結(jié)果相一致;4)WNT5a下調(diào)后的胎鼠可見后腸發(fā)育不良,出生后小鼠解剖顯示直腸發(fā)育差、結(jié)腸擴(kuò)張的腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表現(xiàn)。結(jié)論:1)成功構(gòu)建出表達(dá)WNT5a基因RNA干擾片段的質(zhì)粒并順利進(jìn)行跨胎盤RNAi研究,完善了RNAi技術(shù)平臺;2)證實了WNT5a在腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起到重要作用,下調(diào)后可能抑制腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞在腸道中的遷移和定植,導(dǎo)致腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R726.2

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本文編號：2502173