【摘要】：褐飛虱Nilaparvata lugens(St?l)是我國(guó)水稻上的主要害蟲(chóng),專一性吸食必需氨基酸缺乏的水稻篩管液。褐飛虱必需氨基酸的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源頗受關(guān)注,一般認(rèn)為與體內(nèi)共生菌有關(guān)。利用基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),前人初步構(gòu)建了褐飛虱及其體內(nèi)類酵母共生菌(YLS)參與必需氨基酸的合成途徑。組氨酸是必需氨基酸的一種,本文進(jìn)一步對(duì)其合成途徑的相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和來(lái)源分析,并利用RNAi技術(shù)研究了部分重要基因在褐飛虱生長(zhǎng)、發(fā)育和存活中的作用。結(jié)果分述如下:1.組氨酸合成基因的克隆與來(lái)源分析本研究利用生物信息學(xué)手段,從褐飛虱類酵母共生菌基因組中預(yù)測(cè)得到合成組氨酸的7個(gè)基因,通過(guò)RT-PCR克隆得到了全部序列,分別命名為EdeHis1、EdeHis2、EdeHis3、EdeHis4、EdeHis5、EdeHis6和EdeHis7。序列比對(duì)、相似性分析結(jié)果表明這7個(gè)基因與真菌基因同源。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明7個(gè)基因均與肉座菌目真菌在進(jìn)化關(guān)系上最為相近。采用褐飛虱中腸、頭、足、體壁、卵巢和脂肪體c DNA作為模板,進(jìn)行定量PCR分析,結(jié)果表明在含有類酵母共生菌的腹部脂肪體中的表達(dá)量顯著高于中腸、頭、足和體壁中的表達(dá)量。另外,利用褐飛虱頭、翅和腹的基因組DNA作為模板,進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,在不含YLS的頭和翅中不能擴(kuò)增出片段。綜合這些結(jié)果,我們認(rèn)為克隆得到的這7個(gè)組氨酸合成基因均來(lái)源于YLS而非褐飛虱或者ARS。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步構(gòu)建了褐飛虱體內(nèi)組氨酸合成通路。2.組氨酸合成關(guān)鍵基因EdeHis1的研究選擇組氨酸合成關(guān)鍵基因EdeHis1進(jìn)一步研究。注射濃度為0.05、0.5和1.5μg/μL的dsEdeHis1,不管是飼養(yǎng)于水稻苗還是缺組氨酸的人工飼料上,在第三天時(shí),目的基因的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著下調(diào)。兩種食物對(duì)EdeHis1表達(dá)量的影響不顯著(p=0.22)。另外,EdeHis1的沉默導(dǎo)致褐飛虱體內(nèi)游離組氨酸含量顯著低于對(duì)照組,且初羽化雌雄成蟲(chóng)的體重顯著低于對(duì)照,表明EdeHis1參與了褐飛虱體內(nèi)組氨酸的合成,且與褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。通過(guò)注射和喂食不同濃度的組氨酸,發(fā)現(xiàn)組氨酸的缺失引起EdeHis1表達(dá)量的上調(diào),而組氨酸的過(guò)量抑制其表達(dá)。但注射或飼喂不同濃度的外源組氨酸,褐飛虱體內(nèi)的游離組氨酸與對(duì)照無(wú)顯著差異,表明褐飛虱體內(nèi)的組氨酸含量有一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制。另外,利用原核表達(dá)的EdeHis1蛋白,經(jīng)葡聚糖凝膠層析技術(shù)研究表明,外源組氨酸的存在導(dǎo)致EdeHis1構(gòu)型由二聚體形式轉(zhuǎn)變?yōu)榱垠w。3.組氨酸合成基因EdeHis2及EdeHis6的研究EdeHis2、EdeHis6基因也是組氨酸合成中的重要基因,RNA干擾結(jié)果表明,注射dsEdeHis2或dsEdeHis6后,褐飛虱的死亡率顯著升高、若蟲(chóng)發(fā)育歷期有所延長(zhǎng),這表明干擾EdeHis2或EdeHis6對(duì)褐飛虱生長(zhǎng)、發(fā)育、存活有一定的負(fù)面作用。另外,干擾EdeHis6后,部分褐飛虱表現(xiàn)為翅畸形,雌雄蟲(chóng)表現(xiàn)有所差異,其中雌蟲(chóng)有11%的翅發(fā)育不完全,雄蟲(chóng)有13%的翅呈現(xiàn)彎折,表明EdeHis6在褐飛虱翅發(fā)育中可能具有重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.112.3

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本文編號(hào)：2482750