【摘要】：目的:探討健脾解毒方對大腸癌腫瘤血管形成相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法:采用水提法制作健脾解毒方粗提取物,MTT法檢測健脾解毒方粗提取物對大腸癌HT29細(xì)胞增殖的影響,Graph Pad Prism 5軟件計算IC50(50%inhibitory concentration)值,Affymetrix基因表達(dá)譜芯片檢測健脾解毒方干預(yù)后有顯著差異表達(dá)的基因并進(jìn)行路徑富集分析,基于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)軟件對腫瘤血管形成的相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析并構(gòu)建網(wǎng)路關(guān)系圖,Western印跡法驗證腫瘤血管形成相關(guān)差異表達(dá)的關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:健脾解毒方粗提取物能夠抑制大腸癌HT29細(xì)胞增殖,處理24,48及72 h后的IC50值分別為13.060,9.646及8.448 mg/m L。Affymetrix基因表達(dá)譜芯片檢測健脾解毒方干預(yù)后顯著上調(diào)的基因218個,顯著下調(diào)的基因252個,主要為生物合成、新陳代謝、細(xì)胞凋亡、抗原提取、血管生成等相關(guān)基因,其中腫瘤血管形成相關(guān)差異表達(dá)基因12個。IPA軟件分析結(jié)果顯示健脾解毒方干預(yù)后可使大腸癌中的鞘磷脂磷酸二酯酶3(sphingomyelin phosphodiesterase 3,SMPD3),VEGF,血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA),整合數(shù)α亞基1(integrin subunit alpha 1,ITGA1),組織蛋白酶B(cathepsin B,CTSB),組織蛋白酶S(cathepsin S,CTSS)等基因下調(diào),GRB2相關(guān)結(jié)合蛋白2(GRB2 associated binding protein 2,GAB2),PLAUR(plasminogen activator,urokinase receptor)等基因上調(diào)。Western印跡檢測顯示健脾解毒方能明顯下調(diào)磷酸化mTOR(phospho-mTOR,P-mTOR),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3),缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和VEGF蛋白表達(dá),明顯上調(diào)磷酸化P53(phospho-P53,P-P53)蛋白表達(dá)。結(jié)論:健脾解毒方可能通過影響mTOR-HIF-1α-VEGF信號通路抑制大腸癌腫瘤血管形成,這可能是健脾解毒方治療大腸癌的作用機(jī)制之一。
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of Jianpi jiedu recipe on the expression of angiogenic genes in colorectal cancer. Methods: the crude extract of Jianpi jiedu recipe was prepared by water extraction. The effect of Jianpi jiedu recipe crude extract on the proliferation of colorectal cancer HT29 cells was detected by MTT method. The IC50 (50%inhibitory concentration) value was calculated by, Graph Pad Prism 5 software. Affymetrix gene expression profile microarray was used to detect the differentially expressed genes after the intervention of Jianpi jiedu recipe and the path enrichment analysis was carried out. Based on the mammal rapamicin target protein (mammalian target of rapamycin, MTOR) the signal pathway uses IPA (Ingenuity Pathway Analysis) software to analyze the differentially expressed genes related to tumor angiogenesis and construct the network diagram. Western staining was used to verify the protein expression of key genes related to tumor angiogenesis. Results: the crude extract of Jianpi jiedu recipe could inhibit the proliferation of colorectal cancer HT29 cells. The IC50 values of 24 h, 48 h and 72 h after treatment were 13.060. 9.646 and 8.448 mg/m L.Affymetrix gene expression profiles were used to detect 218 genes significantly upregulated and 252 genes down-regulated after Jianpi Jiedu recipe intervention, mainly biosynthesis. Metabolism, apoptosis, antigen extraction, angiogenesis and other related genes, Among them, 12 differentially expressed genes related to tumor angiogenesis were analyzed by IPA software. The results of IPA software analysis showed that the intervention of Jianpi jiedu recipe could make sphingomyosphatide phosphodiesterase 3 (sphingomyelin phosphodiesterase 3, SMPD 3), VEGF, in colorectal cancer. Vascular endothelial growth factor A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA), integration number 偽 subunit 1 (integrin subunit alpha 1, cathepsin B (cathepsin B, CTSB), cathepsin S (cathepsin S, CTSS) were down-regulated. GRB2 related binding protein 2 (GRB2 associated binding protein 2, GABA 2), PLAUR (plasminogen activator,urokinase receptor) and other genes were up-regulated. Western blot analysis showed that Jianpi jiedu recipe could significantly down-regulate the phosphorylation of mTOR (phospho-mTOR,P-mTOR). The expression of signal transduction and transcription activating factor 3 (signal transducer and activator of transcription 3), hypoxia inducible factor 1 偽 (hypoxia inducible factor-1 偽 (HIF-1 偽) and VEGF protein were significantly up-regulated by phosphorylation of p53 (phospho-P53,P-P53) protein. Conclusion: Jianpi jiedu recipe may inhibit tumor angiogenesis of colorectal cancer by affecting mTOR-HIF-1 偽-VEGF signal pathway, which may be one of the mechanisms of Jianpi jiedu recipe in the treatment of colorectal cancer.
【作者單位】： 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中西結(jié)合科;中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院普外科;中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腫瘤科;湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科;湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81273722) 湖南省中醫(yī)藥管理局科研課題(201135)~~
【分類號】：R285

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