【摘要】：目的:比對分析得到綿羊基因組MHC區(qū)段DRA的基因序列及其exon2的序列;構(gòu)建釀酒酵母表面展示重組載體pYD1-DRA;對感染布魯氏菌及正常的綿羊個體的DRA基因exon2進行DNA池化擴增,同時分析其多態(tài)性,獲得多態(tài)位點;對OLA-DRA基因exon2兩端進行快速定點基因突變,突變?yōu)樘囟盖形稽c;構(gòu)建DRA基因釀酒酵母表面展示庫;檢測OLA-DRA基因是否穩(wěn)定表達展示在釀酒酵母細胞表面,探索初步篩選與綿羊DRA蛋白相結(jié)合的布魯氏菌抗原肽的可行途徑。為綿羊抗病選育以及進一步研究MHC的抗病機理奠定基礎(chǔ),并提供一定的參考依據(jù)和理論支持,從而加快分子遺傳抗病育種的進程。方法:1、將牛和綿羊MHCⅡDRA基因mRNA序列利用BLAST比對得到它們的基因序列和外顯子序列,繼而用GenBank中的SNP數(shù)據(jù)庫查尋牛和綿羊的SNP位點。利用DNAMAN6.0軟件分析牛MHCⅡDRA外顯子的SNP位點,得到牛MHCⅡDRA有豐富多態(tài)性的外顯子序列,通過DNAStar SeqMan軟件比對分析獲得與這些外顯子相似性較高的綿羊MHCⅡDRA基因exon2序列。2、本試驗利用布魯氏菌虎紅平板凝集診斷試劑盒和試管凝集試驗對240只綿羊血液樣本進行布魯氏菌陽性血清檢測,然后利用PCR結(jié)合SSCP技術(shù)對MHCⅡDRA基因exon2的SNP位點進行檢測,采用DNA池PCR產(chǎn)物直接測序法對600例布魯氏菌陽性和陰性個體OLA-DRA基因exon2的SNPs再次進行檢測,并對含有SNP位點的exon2進行克隆測序,運用分子生物學軟件進行比對分析多態(tài)位點。3、通過基因定點突變方法插入特定限制性酶切位點,構(gòu)建OLA-DRA基因酵母表面展示庫,進行蛋白誘導(dǎo)表達及細胞免疫熒光試驗,利用熒光顯微鏡檢測OLA-DRA蛋白是否展示在酵母細胞表面。結(jié)果:1、通過生物信息學分析及基因克隆測序,得到與牛同源性高的綿羊MHCⅡDRA的基因序列,并于NCBI發(fā)布,GenBank登錄號為KR422362,并分析比對得到其具有多態(tài)性的exon2的序列。2、利用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測羊種布魯氏菌感染的陰陽性,在240只綿羊中共檢測發(fā)現(xiàn)陰性個體174只,陽性個體66只,并對陽性個體進行復(fù)檢,最終布魯氏菌陽性檢出率為27.5%。3、利用PCR結(jié)合SSCP技術(shù)的方法對這240只綿羊MHCⅡDRA基因exon2進行檢測,發(fā)現(xiàn)綿羊DRA基因exon2具有多態(tài)性,exon2序列第143bp發(fā)生了堿基突變,由G變?yōu)锳,氨基酸由Arg變?yōu)镠is。4、通過基因定點突變法成功插入特定限制性酶切位點,并成功構(gòu)建出OLA-DRA基因酵母表面展示庫,經(jīng)蛋白誘導(dǎo)表達及細胞免疫熒光試驗,于熒光顯微鏡下顯現(xiàn)綠色熒光,DRA蛋白成功展示于酵母細胞表面。結(jié)論:1、通過PCR-SSCP方法對綿羊OLA-DRA基因的exon2進行多態(tài)性分析,并對PCR產(chǎn)物進行直接測序,發(fā)現(xiàn)exon2具有多態(tài)性。2、分析OLA-DRA基因的多態(tài)位點,對其exon2全長246bp進行測序序列對比分析,獲得3個多態(tài)位點,exon2第46位堿基C/G、第120位堿基G/A和第143位堿基G/A具有多態(tài)性,這與免疫基因編碼產(chǎn)物的多樣性相一致。3、本研究構(gòu)建OLA-DRA基因酵母表面展示庫,經(jīng)誘導(dǎo)表達及細胞免疫熒光后,在熒光顯微鏡下激發(fā)出綠色熒光,表明OLA-DRA基因表達蛋白成功展示在酵母細胞表面。
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【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S826
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本文編號：2476170