發(fā)布時間：2019-05-13 21:37

【摘要】：L-天冬氨酸α-脫羧酶(PanD)作為泛酸合成途徑中的重要調(diào)控酶,可以特異性催化L-天冬氨酸脫掉α羧基,生成具有高價值的β-丙氨酸,由L-天冬氨酸生物法生產(chǎn)β-丙氨酸極具工業(yè)化潛能。目前對PanD的研究存在著PanD重組酶基因來源有限、自剪切機制不清晰等問題,此外已發(fā)現(xiàn)的PanD普遍存在底物依賴性失活現(xiàn)象,限制了其工業(yè)化應用。本文選擇不同來源的panD基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中異源表達,并考察了純化后的PanD的自剪切情況、酶學性質(zhì)以及底物失活速率。選擇NCBI panD基因庫中42種尚未有研究報道的panD基因和2種已發(fā)現(xiàn)具有酶制劑開發(fā)潛力的panD基因(谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis),按照E.coli的密碼子偏好性優(yōu)化后,連接到pET28a(+)載體上,然后在E.coli BL21(DE3)中重組表達,構建了44株重組菌。利用親和層析純化獲得相應的重組酶并比較其活力,發(fā)現(xiàn)有6種PanD與C.glutamicum PanD、B.subtilis PanD一樣具有較高的比酶活。不同來源panD基因轉錄翻譯后自剪切情況可以分為幾乎未裂解、部分裂解和基本完全裂解三類。自剪切程度直接影響到酶的活力,孵育可以促進酶裂解成熟,但對酶活的提高并不顯著。氨基酸序列親緣性越近,其自剪切情況也基本相似。研究表明底物L-天冬氨酸對Pan D具有抑制作用,底物濃度越高,抑制作用越強。在底物濃度固定的情況下,剩余酶活與時間呈一級反應關系。測定重組酶的失活速率發(fā)現(xiàn),通常情況下,重組酶的酶活越高,底物失活速率越大。其中杰氏棒桿菌(Corynebacterium jeikeium)來源的PanD的比酶活可達11.8 U·mg-1,是目前報道的最高水平;單核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)來源的PanD不僅酶活較高(8.9 U·mg-1),而且底物失活速率較小,為2.071×10-3 min-1,故對這兩種來源的重組酶的酶學性質(zhì)、底物轉化能力進行了比較分析。PanDL.m、PanDC.j的最適反應溫度均為60℃,最適pH分別為7.0和6.0,它們都在30-50℃,酸性條件下較穩(wěn)定。相同條件下,與100 g·L-1底物L-天冬氨酸反應24 h,PanDL.m和PanDC.j對底物的轉化率分別可到達67.7%和82.2%。
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【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q55

【參考文獻】

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本文編號：2476204