【摘要】：適宜的環(huán)境可以促進蔬菜作物的正常生長和發(fā)育,逆境脅迫會大幅度制約作物的產量和品質。此外,隨著中國工業(yè)化、城市化進程的不斷加快,一系列廢氣、廢水、廢物被排放到空氣、水體、土壤中,累積了大量的重金屬。動植物作為人類的主要食物來源,易被重金屬污染,且重金屬會在其體內不斷積累,人類食用后會對自身健康造成嚴重危害。芹菜(ApiumgraveolensL.)屬于傘形科、芹屬的植物,是一種世界范圍廣泛種植的傘形科蔬菜作物,也是我國廣泛種植的重要葉菜類蔬菜之一。在逆境脅迫、重金屬污染下,芹菜植株的生長和發(fā)育會受到制約和影響。本試驗以芹菜為研究對象,分別從'六合黃心芹'、美國西芹'文圖拉'2個芹菜品種中獲得了Agmt2基因,該基因編碼的這類蛋白被認為可以提高植物的抗逆境能力(尤其是抗重金屬脅迫能力)。對Agmt2基因序列進行分析,并分析芹菜在不同逆境處理的表達圖譜,初步驗證該基因功能。通過大腸桿菌表達,分離純化出AgMT2蛋白,將Agmt2基因轉入到擬南芥中,獲得轉基因植株,以進一步研究芹菜對重金屬脅迫的響應機制。本論文的主要研究結果如下:1、基于本課題組芹菜轉錄組數(shù)據,分別以南京地方品種'六合黃心芹'、美國西芹'文圖拉,為材料,克隆得到2個Agmt2基因。分析表明,芹菜Agmt2基因含有兩段內含子,開放閱讀框序列全長為231 bp,編碼具有76個氨基酸殘基的AgMT2蛋白。'六合黃心芹'與'文圖拉'的Agmt2基因開放閱讀框序列核苷酸相似度為99.56%,氨基酸序列100%一致。多重序列和理化性質分析表明,AgMT2的分子量和等電點分別是7.5 kDa和4.95。多重序列分析發(fā)現(xiàn),金屬硫蛋白2的結構域在高等植物的進化中是高度保守的。進化樹分析結果顯示,AgMT2與同是傘形科的水芹和短果茴芹金屬硫蛋白2的進化關系最近。熒光定量表達分析表明,Agmt2基因在芹菜中的表達具有組織特異性。在8種金屬(Co~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+))和逆境脅迫(高低溫、干旱和鹽處理)處理下,Agmt2基因在'文圖拉,中的表達比'六合黃心芹'中的表達表現(xiàn)出更顯著的上升響應。2、以從芹菜'文圖拉'中克隆得到的Agmt2基因為基礎,構建pET-30a(+)-AgMT2表達載體。構建成功之后,通過大腸桿菌表達,獲得濃度為0.42 mg/mL的AgMT2純化蛋白。SDS-PAGE判斷蛋白大小約為20.1 kDa。此外,將含有AgMT2表達的大腸桿菌細胞和對照細胞同時涂布在含有重金屬離子的培養(yǎng)基上進行處理,鑒定AgMT2的金屬耐受性。結果表明,在受到Cd~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)脅迫后,表達AgMT2的大腸桿菌細胞比對照細胞的耐受性更強,且攜帶Cd~(2+)、Zn~(2+)的能力比Cu~(2+)強。這表明,AgMT2是一種可以有效表達在大腸桿菌中,且具有特異性結合重金屬離子能力的功能蛋白。3、本試驗使用蘸花法,將芹菜'文圖拉'中的Agmt2基因轉入到擬南芥中,結合不同的方法,如培養(yǎng)基篩選、GUS染色、PCR驗證、表型觀察等多種方法鑒定獲得轉基因擬南芥植株。經過種植和篩選,獲得轉基因T3代轉基因擬南芥植株。此外,為了進一步驗證AgMT2的重金屬解毒和自由基清除功能,將轉基因擬南芥植株和對照植株進行15天重金屬處理,分別澆灌100μM的Cd~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和蒸餾水,測定生理指標:谷胱甘肽(GSH)含量、葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性。結果表明:在重金屬脅迫下,轉基因擬南芥植株的GSH含量、總葉綠素含量、SOD活性和POD活性變化量均明顯高于對照植株。這說明,受到重金屬脅迫后,轉Agmt2基因擬南芥植株比對照植株表現(xiàn)出更強的重金屬解毒和自由基清除能力。本研究為傘形科重要蔬菜芹菜的逆境響應的研究提供了資源,為進一步深入開展芹菜新品種選育奠定了基礎。
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【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S636.3

【參考文獻】

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