【摘要】：HECT類泛素蛋白連接酶(HECT E3s)作為一種主要的泛素連接酶類型存在于幾乎所有真核生物的細胞中,這類酶在其羧基端包含有一個由約350個氨基酸組成的HECT結構域。HECT E3s通過選擇性地識別細胞內的活性蛋白并通過26S蛋白酶體介導的降解途徑來調控許多重要的生物過程。HECT E3s的功能目前在動物中已經做了比較深入的研究,發(fā)現(xiàn)其在與疾病相關的各種過程中發(fā)揮著重要的作用。在植物中這一家族中的某些成員在調控植物的生長和發(fā)育的過程如衰老、毛狀體的發(fā)育、非生物脅迫等過程中也發(fā)揮著重要的作用,但是其中所涉及的具體機制仍不清楚。在擬南芥中含有7個HECT E3s,僅UPL3和UPL5基因的表達和功能有初步的研究。為此,本研究通過克隆擬南芥中HECT家族其中6個成員UPL1、UPL2、UPL3、 UPL4、UPL口UPL7的啟動子并連接到GUS報告基因的上游,構建ProUPLs-GUS啟動子活性分析載體,通過農桿菌浸染野生型擬南芥獲得轉基因植株；通過GUS組織化學染色對不同發(fā)育時期和不同組織器官的材料進行染色,從而系統(tǒng)地認識這6個HECT類泛素蛋白連接酶家族基因的表達模式。同時,通過對UPL基因家族的T-DNA插入突變體進行篩選和鑒定,對這些UPL基因單突變情況下的植株表型和功能進行了初步分析。具體獲得的實驗結果如下：(1)在轉基因擬南芥種子萌發(fā)的早期,除了UPL6基因啟動子驅動的GUS報告基因僅在萌發(fā)后2天(2 DAG)的小苗子葉中檢測到表達外,其它UPLs基因的啟動子驅動的GUS基因在2 DAG和5 DAG時在下胚軸、子葉和根尖成熟區(qū)的中柱鞘中均有表達；UPL2和UPL4基因的啟動子還在根尖分生區(qū)和根毛中有活性；UPL4的啟動子在根尖伸長區(qū)的中柱鞘中有活性；7DAG之后整個UPL家族基因的啟動子在新生部位真葉和毛狀體中均有活性；(2)系統(tǒng)地對ProuPLs-GUS啟動子轉基因擬南芥植株在營養(yǎng)和生殖階段的蓮座葉進行染色,發(fā)現(xiàn)UPL1和UPL4啟動子在老葉中活性高于年輕葉；而UPL2和UPL3啟動子在中間齡葉片的活性高于老葉和嫩葉；UPL6基因的啟動子則在老葉和嫩葉中活性相當,且高于中間齡葉片活性；UPL7基因的啟動子在不同葉齡蓮座葉中活性無明顯差異。(3)對轉基因植株花序進行GUS組織化學染色,發(fā)現(xiàn)這六個基因的啟動子在莖、花梗、花托和花萼等組織中均有活性。除UPL1基因在花絲和柱頭上沒有啟動子活性外,其他基因的啟動子都有活性；且UPL2基因的啟動子在花藥中的活性較高。(3)對轉基因植株的角果進行染色,發(fā)現(xiàn)這六個UPL家族成員的啟動子在角果柄中都有活性；UPL2、UPL3、UPL4、UPL6和UPL7的啟動子還在角果的果皮上有活性；在角果發(fā)育的早期UPL3、UPL4和UPL6基因的啟動子還在角果的頂端有活性；UPL2的啟動子在種子中有特異活性；(4)利用三引物法鑒定擬南芥UPL基因家族成員的T-DNA插入突變體并獲得純合體植株,通過qRT-PCR鑒定所篩選純合體的轉錄水平,并對獲得的UPL2、UPL3、UPL4和UPL6基因的純合突變體植株進行包括葉綠素含量、黃綠葉統(tǒng)計、光合效率等衰老表型的觀察和下游相關基因的表達分析,結果表明：從植株生長的25 DAG到67 DAG的觀察期內,各突變體在60 DAG時都表現(xiàn)出輕微的衰老延緩表型,在53 DAG的各突變體的蓮座葉中檢測下游衰老相關基因的表達,發(fā)現(xiàn)衰老負調控相關的NEET基因都有不同程度的上調表達,進一步證實UPL2、UPL3、UPL4和UPL6基因可能跟衰老調控有一定的關系。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：福建農林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2466381