【摘要】：青錢柳中含有多種活性次生代謝產(chǎn)物,已被批準(zhǔn)為一種新的食品原料,但由于其繁育困難導(dǎo)致資源匱乏,嚴(yán)重制約了其開發(fā)利用。三萜是其中重要的活性成分之一,本實(shí)驗室利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立了穩(wěn)定的青錢柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,以之生產(chǎn)三萜酸,采用添加外源誘導(dǎo)子方法以促進(jìn)三萜的合成,已從信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和MAPK途徑初步探索了ANE(黑曲霉誘導(dǎo)子)的誘導(dǎo)作用機(jī)制。為了更加深入地探索ANE促進(jìn)細(xì)胞合成三萜的作用機(jī)制,本文研究了ANE誘導(dǎo)作用下青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶的變化規(guī)律,采用Illumina HiSeq 4000測序技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析,以發(fā)掘青錢柳轉(zhuǎn)錄水平的生物信息,對ANE誘導(dǎo)下抗氧化系統(tǒng)、調(diào)控次生代謝途徑的調(diào)控因子、JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及三萜代謝途徑中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了全面的分析,并對關(guān)鍵酶基因CpSS(青錢柳鯊烯合成酶)進(jìn)行了克隆及生物信息學(xué)分析,從基因表達(dá)調(diào)控的角度探討了ANE誘導(dǎo)調(diào)控青錢柳萜類代謝的分子機(jī)制。主要結(jié)果和結(jié)論如下:(1)ANE誘導(dǎo)作用下青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶的活性變化規(guī)律:加入ANE誘導(dǎo)10 h左右,細(xì)胞三萜含量開始升高,至60 h時達(dá)到最高值,含量由12.47μg/mg增至36.46μg/mg,為對照組的3.36倍。ANE誘導(dǎo)作用下,過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和磷脂酶(PLC)這五種抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶的活性均發(fā)生了明顯的時序性變化,各酶的活性均較對照組有明顯的提高。SOD的活性分別在誘導(dǎo)1 h、8 h、66 h時出現(xiàn)了3個峰值,POD酶的活性在分別在誘導(dǎo)1 h、8 h、21 h、66 h時出現(xiàn)4個峰值,CAT酶的活性分別在誘導(dǎo)2 h、8 h、24 h、54 h和66 h時出現(xiàn)了5個峰值,PAL酶的活性分別在誘導(dǎo)7 h、18 h和42 h時出現(xiàn)了3個峰值,PLC酶的活性分別在誘導(dǎo)6 h和24 h時出現(xiàn)了峰值。(2)ANE作用下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序與分析:本文采用Illumina HiSeq 4000測序平臺分別對青錢柳懸浮細(xì)胞對照組(未添加ANE)、ANE誘導(dǎo)20 h和60 h這三個樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了67230個高質(zhì)量Unigene序列,平均長度和N50分別為744 bp和1379 bp;將組裝得到的67230個Unigenes通過BlastX與NR、Pfam、String、Swissprot、GO、COG和KEGG七個公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析,有49.78%的Unigenes比對到公共數(shù)據(jù)庫中;共有7694個Unigenes注釋到25個COG功能分類中;共有19398個Unigenes注釋到GO功能分類中,獲得了128396條GO注釋信息。此外,獲得了14986個SSR序列,為進(jìn)一步的遺傳學(xué)分析提供了豐富的信息。(3)ANE作用下細(xì)胞差異表達(dá)基因分析:通過對細(xì)胞Unigenes的差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)20 h、誘導(dǎo)60 h與CK對照組的DEGs(差異表達(dá)基因)分別有24788、24336個;其中與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的20個POD、3個SOD和1個CAT候選基因發(fā)生了上調(diào);與JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的9個JAZ、2個JAR和12個MYC2候選基因發(fā)生了差異表達(dá);鑒定出了15990條候選TF(轉(zhuǎn)錄因子)基因,其中可能參與調(diào)控三萜代謝途徑的bHLH、ERF、NAC、C2H2和WRKY等TF家族的差異表達(dá)基因較多;鑒定出了75個參與萜類骨架生物合成途徑的候選基因及22個參與三萜類生物合成途徑的候選基因。此外,采用RT-qPCR檢測對與三萜代謝相關(guān)的12個表達(dá)量上調(diào)基因進(jìn)行驗證,結(jié)果顯示這12個基因表達(dá)量上調(diào),與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)一致。(4)CpSS全長基因克隆及序列分析:本文根據(jù)青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序信息,注釋到了鯊烯合成酶的候選基因;以該基因序列為基礎(chǔ),采用RT-PCR和RACE技術(shù)從細(xì)胞中克隆出了全長為1667 bp的CpSS基因cDNA序列,該序列包含了一個1245 bp的完整ORF,編碼414個氨基酸;CpSS序列與胡桃SS基因的相似度最高,相似度達(dá)到了97%,與白樺、葡萄、大豆、甘草、可可等物種的相似度都達(dá)85%以上,與胡桃和白樺的親緣性關(guān)系最近。序列分析表明,CpSS蛋白屬于不穩(wěn)定親水蛋白,具有典型的鯊烯合成酶保守區(qū)和結(jié)構(gòu)域,存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中,由多個α螺旋組成空穴狀結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)與大多數(shù)植物鯊烯合成酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)相似。綜上所述,青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在ANE誘導(dǎo)作用下,抗氧化相關(guān)酶的活性明顯提高,通過JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo),調(diào)控三萜合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子,使其途徑中的關(guān)鍵酶基因發(fā)生差異表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞中三萜的合成與積累。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;TS201

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2452017