發(fā)布時(shí)間：2019-03-29 21:19

【摘要】：基因治療是指將外源基因物質(zhì)輸送到靶細(xì)胞、以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷,從而達(dá)到治療目的,已被證明是一種有效的具有低副作用的癌癥治療新手段。非病毒載體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、聚合物、樹枝狀大分子和多肽等,因其具有良好的安全性和生物相容性、低的免疫原性、易于化學(xué)修飾和大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)而引起了廣泛關(guān)注。但與病毒載體相比,較低的基因轉(zhuǎn)染效率一直是困擾其應(yīng)用的瓶頸。其中,陽(yáng)離子聚合物可通過(guò)中和DNA的負(fù)電荷而將其壓縮成納米顆粒,從而保護(hù)DNA不被降解,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞攝取,將DNA輸送到細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。但是,通過(guò)正/負(fù)靜電相互作用形成的陽(yáng)離子聚合物/核酸藥物復(fù)合物納米顆粒熱力學(xué)上非常穩(wěn)定,難以解離釋放出DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染；同時(shí),陽(yáng)離子聚合物在細(xì)胞內(nèi)有可能與參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)如mRNA、酶等相互作用,干擾轉(zhuǎn)染過(guò)程,導(dǎo)致核酸藥物難以發(fā)揮藥效。因此,設(shè)計(jì)能夠響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境從而能夠快速釋放出DNA等核酸藥物的載體,是提高核酸藥物藥效的關(guān)鍵。本論文第一部分設(shè)計(jì)了一種基于氧化響應(yīng)的電荷反轉(zhuǎn)型聚合物的膜融合型基因輸送體系,成功地解決了這些難題。腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常的生理特點(diǎn)使其含有大量的活性氧自由基(ROS),包括過(guò)氧化氫(H202)、超氧陰離子(O2-)、氫氧根自由基(OH·),這些活性氧自由基能夠?qū)⒈脚鹚峄蝓パ趸癁榉踊�。該聚合物是含有p-硼酸芐基季銨鹽的陽(yáng)離子鍵合物(B-PDEAEA),能與帶負(fù)電的DNA等核酸藥物通過(guò)靜電自組裝形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物。進(jìn)入細(xì)胞后,硼酸被ROS氧化時(shí)發(fā)生去酚基芐醇反應(yīng),季銨鹽轉(zhuǎn)變?yōu)槿?jí)胺,隨后通過(guò)胺基的自催化酯鍵水解生成帶負(fù)電的聚丙烯酸,從而與帶負(fù)電的核酸藥物相互排斥而與之快速解離,釋放出核酸藥物進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染。進(jìn)一步地,通過(guò)在陽(yáng)離子納米復(fù)合物表面包裹一層脂質(zhì)體膜并調(diào)節(jié)其組成,使該脂質(zhì)層能夠以類似于病毒入胞的膜融合方式,將納米復(fù)合物直接“吐”入細(xì)胞質(zhì)中,避開了溶酶體陷阱因而避免了DNA被溶酶體中的酶降解。該載體系統(tǒng)在體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在,循環(huán)時(shí)間長(zhǎng),并能夠在腫瘤部位有效蓄積,可以成功將治療基因TRAIL輸送到腫瘤部位,實(shí)現(xiàn)比阿霉素更好的抑瘤效果,且毒副作用很低。本論文第二部分基于上述氧化響應(yīng)的電荷反轉(zhuǎn)型聚合物設(shè)計(jì)了兩種具有抗血清特性的陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因輸送體系,它們能夠提高原有陽(yáng)離子聚合物抗血清能力,防止聚合物和DNA形成的納米復(fù)合物在高血清條件下過(guò)早解離,表面大量的正電荷還能促進(jìn)細(xì)胞攝取,增強(qiáng)腫瘤滲透能力,同時(shí)陽(yáng)離子脂質(zhì)體能夠刺激細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,有利于輸送體系從溶酶體逃逸后,納米復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中ROS刺激作用下發(fā)生電荷反轉(zhuǎn),解離并釋放DNA。該體系在50%甚至100%的高血清條件下在細(xì)胞水平上依然能夠維持非常高效的轉(zhuǎn)染效率——通過(guò)胞膜窖介導(dǎo)的內(nèi)吞作用快速被細(xì)胞攝取,從溶酶體逃逸,解離,釋放DNA進(jìn)入細(xì)胞核。在A549腹腔移植瘤模型中成功將治療基因TRAIL輸送到腫瘤部位,表現(xiàn)出明顯高于B-PDEAEA/TRAIL,Lipo 2000/TRAIL和PEI/TRAIL的抑瘤效率,與化療藥物紫杉醇(PTX)相媲美,同時(shí)沒有毒副作用。在4T1-Luc-GFP轉(zhuǎn)移瘤模型中表現(xiàn)出比PEI/TRAIL更好的抗轉(zhuǎn)移能力,小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶大大減少。本論文第三部分基于以上氧化響應(yīng)的電荷反轉(zhuǎn)型聚合物B-PDEAEA的設(shè)計(jì)思路和應(yīng)用,設(shè)計(jì)合成了一系列基于苯硼酸氧化特性的的去電荷陽(yáng)離子聚合物,其中包括p-硼酸基卞溴季銨化的聚甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(B-PDEAEMA),以及溴代(2-丙烯酰氧)乙基(p-硼酸芐基)二乙銨與PEI或PAMAM通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)制備得到的季銨化水溶性聚合物B-PEI和B-PAMAM。這些陽(yáng)離子聚合物在細(xì)胞水平上均獲得高效的轉(zhuǎn)染效率,基于B-PDEAEMA設(shè)計(jì)的膜融合型基因輸送體系在SW480結(jié)腸癌移植瘤模型中成功將治療基因TRAIL輸送到腫瘤部位,實(shí)現(xiàn)比化療藥物5-氟尿嘧啶更好的抑瘤效果。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R450
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本文編號(hào)：2449893