【摘要】：溫度依賴型性別決定(TSD)是環(huán)境性別決定(ESD)模式中的重要表現(xiàn)形式之一,其個(gè)體性別取決于胚胎發(fā)育過程中的環(huán)境溫度,但其具體分子調(diào)控機(jī)理仍然不明確。之前對(duì)爬行動(dòng)物TSD的研究,多集中在不同物種性別決定模式的描述、激素在TSD中的作用以及調(diào)控TSD基因的挖掘等方面;表觀遺傳學(xué)最新研究表明,非編碼RNA和DNA甲基化修飾可能是爬行動(dòng)物TSD模式的重要調(diào)控機(jī)制。cyp19a1基因編碼產(chǎn)生的芳香化酶是將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶,是調(diào)控爬行動(dòng)物TSD模式的重要基因,也是性別相關(guān)miRNAs的一個(gè)重要潛在靶基因。因此,本研究以烏龜為研究對(duì)象,在三個(gè)溫度下(26℃、29℃和32℃)孵化龜卵,對(duì)烏龜?shù)腡SD模式進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)鑒定不同孵化溫度下性腺差異表達(dá)的miRNAs,并且還以cyp19a1基因?yàn)楹蜻x基因,研究其甲基化修飾對(duì)烏龜性別決定的影響。本研究獲得如下重要結(jié)果:1.孵化溫度對(duì)烏龜性別決定的影響在26℃、29℃和32℃三個(gè)溫度下孵化烏龜卵并進(jìn)行性別鑒定,結(jié)果顯示:26℃、29℃和32℃孵化條件下的雌性性別比率分別為3.3%、36.6%和100%,證明了烏龜屬于典型的溫度依賴型性別決定動(dòng)物(TSD),同時(shí)屬于TSD Ia類,即高溫是雌性產(chǎn)生溫度,低溫是雄性產(chǎn)生溫度,這也為后續(xù)烏龜TSD相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。2.不同孵化溫度下烏龜性腺中差異表達(dá)miRNAs的鑒定在烏龜孵化的溫度敏感期,采集了AKG復(fù)合體樣品,通過下代測(cè)序技術(shù),分析鑒定了溫度敏感期內(nèi)(TSP)不同孵化溫度下烏龜性腺差異表達(dá)的miRNAs。首次確定了1013個(gè)已知miRNAs和730個(gè)新miRNAs,其中有18個(gè)miRNAs在不同孵化溫度下存在表達(dá)差異。通過qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了7個(gè)miRNAs的表達(dá)式模式與測(cè)序結(jié)果一致。對(duì)預(yù)測(cè)得到的miRNAs的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果表明內(nèi)吞作用和軸突引導(dǎo)通路可能是參與烏龜TSD過程中的重要通路。這些結(jié)果表明miRNAs可能參與了烏龜?shù)男詣e決定過程。3.不同孵化溫度下烏龜cyp19a1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究通過TA克隆和DNA測(cè)序等技術(shù),成功克隆了烏龜cyp19a1基因5'側(cè)翼區(qū)序列,并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了該區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),初步確定了烏龜cyp19a1基因核心啟動(dòng)子區(qū)域,并利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)其熒光活性,結(jié)果證實(shí)了該區(qū)域具有啟動(dòng)子活性。通過亞硫酸氫鹽測(cè)序等技術(shù),檢測(cè)了AKG復(fù)合體中cyp19a1基因啟動(dòng)子區(qū)在不同孵化溫度下的甲基化修飾模式。結(jié)果表明,烏龜cyp19a1基因啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)CpG位點(diǎn)的整體甲基化水平在不同孵化溫度間存在顯著差異,雌性孵化溫度下(32℃)的甲基化發(fā)生率極顯著低于雄性孵化溫度(26℃)(P0.01),并且顯著低于中間溫度(29℃)(P0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR及ELIAS結(jié)果表明,在雌性孵化溫度下(32℃),cyp19a1基因的表達(dá)量及雌激素水平顯著高于雄性孵化溫度(26℃)及中間溫度(P0.01)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明雌性孵化溫度(FPT)能夠通過降低cyp19a1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平,來提高cyp19a1基因的表達(dá)水平以及雌激素水平,從而進(jìn)一步?jīng)Q定烏龜?shù)男詣e。這證明了cyp19a1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化修飾對(duì)孵化溫度的響應(yīng),可能是烏龜TSD的重要調(diào)控機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2446525