【摘要】：乳糖酶(lactase),學(xué)名 β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase,EC3.2.1.23),催化乳糖水解作用,將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖,或發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)生成低聚半乳糖。目前乳糖酶在制備低乳糖牛乳制品等方面廣泛應(yīng)用,可以有效地降低乳糖不耐受癥。其中來源于乳酸菌的乳糖酶為中性乳糖酶,安全性較高,最適催化溫度介于40℃～60℃之間,可滿足生產(chǎn)乳制品的要求,但其不能分泌到胞外,分離純化的難度很大,給大規(guī)模生產(chǎn)帶來困難。因此本文對(duì)來自于乳酸菌的乳糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢羞M(jìn)行克隆于表達(dá)。本文對(duì)來自乳酸菌產(chǎn)馬乳酒乳桿菌ZW3(Lactobacillus kefiranofaciens ZW3)的乳糖酶基因LacLM進(jìn)行生物信息學(xué)分析,該基因全長2833bp,可編碼由948個(gè)氨基酸組成的蛋白,其編碼的β-D-半乳糖苷酶為一疏水性蛋白,其中大亞基LacL全長1887bp,可編碼628個(gè)氨基酸,其中小亞基LacM全長963bp,可編碼320個(gè)氨基酸,大小亞基有17bp的重疊序列,大小亞基都不含信號(hào)肽,均屬于非分泌型胞內(nèi)蛋白。本文又探索了以馬乳酒樣乳桿菌ZW3基因組編碼的乳糖酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行克隆表達(dá)。以馬乳酒樣乳桿菌ZW3基因組為模板,PCR擴(kuò)增得到LacL、LacM兩個(gè)乳糖酶大小亞基片段,分別經(jīng)EcoR I和SnaB I雙酶切后,分別連接pPIC9K質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,并驗(yàn)證其核苷酸序列正確無誤。將重組質(zhì)粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分別電轉(zhuǎn)入畢赤酵母 GS115,構(gòu)建 pPIC9K-LacL-GS115重組子和pPIC9K-LacM-GS115重組子,通過篩選抗G418濃度達(dá)到3.0mg/mL的菌株,得到了具有多拷貝基因的重組子。pPIC9K-LacL-GS115重組子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證,cDNA上存在LacL片段,并可檢測(cè)到乳糖酶酶活性為1.17U/mL。pPIC9K-LacM-GS115重組子誘導(dǎo)表達(dá)120h后,其發(fā)酵液上清經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)到目的條帶,但沒有表現(xiàn)乳糖酶活性。通過對(duì)畢赤酵母pPIC9K-LacL-GS115重組子搖瓶條件下的培養(yǎng)條件優(yōu)化,乳糖酶酶活最高達(dá)到了1.44 U/mL,比優(yōu)化前提高了23%。
[Abstract]:Lactase (lactase), (尾-D-galactosidase, EC 3.2.1.23) catalyzes lactose hydrolysis, decomposing lactose into galactose and glucose, or producing oligosaccharide by transglycoside reaction. Lactase is widely used in the preparation of low lactose cow dairy products, which can effectively reduce lactose intolerance. The lactase derived from lactic acid bacteria is neutral lactase with high safety. The optimum catalytic temperature is between 40 鈩，

本文編號(hào)：2444584