【摘要】：太平洋鱈(Gadus macrocephalus)是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類。隨著海洋漁業(yè)的快速發(fā)展,太平洋鱈野生資源不斷下降,人工繁育亟待展開。本實驗室太平洋鱈人工育苗技術(shù)日漸成熟,并在育苗過程中發(fā)現(xiàn)太平洋鱈在仔魚期出現(xiàn)大批量死亡現(xiàn)象。為探究這一現(xiàn)象,本實驗對干擾素系統(tǒng)的信號通路進(jìn)行初步研究,并通過對干擾素系統(tǒng)相關(guān)基因TLR3,MDA5,IPS1,IRF3,IRF7和ATG5基因的轉(zhuǎn)錄水平的測定來衡量干擾素系統(tǒng)在太平洋鱈早期發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律,為太平洋鱈人工育苗早期的疾病防治提供理論基礎(chǔ)。本實驗根據(jù)實驗室已獲得的轉(zhuǎn)錄組信息對TLR3,MDA5,IPS1,IRF3,IRF7和ATG5基因設(shè)計擴(kuò)增引物,以太平洋鱈成魚的腎組織為實驗材料,通過基因克隆測序,獲得目的基因片段。為探究干擾素系統(tǒng)在太平洋鱈早期發(fā)育中的作用特點,本實驗建立了絕對熒光定量PCR檢測方法,分別對6個目的基因在太平洋鱈各組織和太平洋鱈仔魚期中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了檢測。此外,本實驗利用Poly(I:C)分別對太平洋鱈2日齡和12日齡仔魚進(jìn)行浸泡,分別對目的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并對相同基因的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。實驗結(jié)果如下:太平洋鱈TLR3基因cDNA序列長3322bp,不包含完整閱讀框(Open reading frame,ORF),序列中最長閱讀框編碼377個氨基酸。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中TLR3的表達(dá)水平結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為:y=-3.1475x+36.756 R2=0.9962;TLR3基因在太平洋鱈的各組織中均出現(xiàn)了表達(dá),其中肝中TLR3的的表達(dá)量顯著高于其他組織,在心臟和胸腺中表達(dá)量其次,在鰓,腦和肌肉中表達(dá)量較少。太平洋鱈MDA5基因cDNA序列長2604bp,不包含完整閱讀框,序列中最長閱讀框編碼844個氨基酸。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中MDA5的表達(dá)水平結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為:y=-3.2154x+36.154 R2=0.9949;MDA5基因在太平洋鱈的各組織中均出現(xiàn)了表達(dá),其中腎中MDA5的表達(dá)量顯著高于其他組織,在心臟,腸和脾中表達(dá)量其次,在腦和肌肉中表達(dá)量較少。太平洋鱈ATG5序列長895bp,含有完整的開放閱讀框,編碼275個氨基酸,其編碼的蛋白質(zhì)分子量約為32.2kDA。經(jīng)核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn),太平洋鱈ATG5與半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)ATG5的相似性均高達(dá)87.27%。利用太平洋鱈與其它物種ATG5核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果表明ATG5系統(tǒng)進(jìn)化樹反映的親緣關(guān)系基本符合傳統(tǒng)分類學(xué)觀點,氨基酸序列分析結(jié)果顯示了ATG5具有較高的保守性。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中ATG5的表達(dá)水平結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為:y=-2.8646X+31.989 R2=0.998;ATG5基因的轉(zhuǎn)錄在太平洋鱈的各組織中都有表達(dá),肝、脾和腎表達(dá)量高于其他組織。太平洋鱈IPS1基因cDNA序列長1539bp,不包含完整閱讀框,序列中最長閱讀框編碼161個氨基酸。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中IPS1的表達(dá)水平結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為:y=-3.1287x+34.206 R2=0.9868其中腎和肝中IPS1的的表達(dá)量顯著高于其他組織,在胸腺,肌肉中表達(dá)量其次,在腦和鰓中表達(dá)量較少,其中在腦中的表達(dá)量最少。太平洋鱈IRF3序列長1878bp,包含完整開放閱讀框,長1377bp,編碼459個氨基酸,其編碼的蛋白質(zhì)分子量約為51kDa。經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)太平洋鱈IRF3的氨基酸序列包括1個含有5個保守色氨酸殘基的DNA結(jié)合域(DNA binding domain,DBD)和1個保守的C端IRF關(guān)聯(lián)域(IRF association domain,IAD);系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明太平洋鱈IRF3與其他物種的IRF3親緣關(guān)系較近。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中IRF3的表達(dá)水平結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為:y=-3.3449X+41.001 R2=0.9896;各組織絕對定量結(jié)果顯示性腺,肝和胸腺表達(dá)量高于其他組織。太平洋鱈IRF7序列長為2032bp,包括一個38bp的5'UTR和一個668bp的3'UTR,含有完整ORF,長度為1323bp,編碼440個氨基酸,分子量約為50118Da,序列中含有一個polyA加尾信號(AATAAA),5個mRNA不穩(wěn)定信號(ATTTA);經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)太平洋鱈IRF7 N端有個保守的DNA結(jié)合域,包含4個保守的色氨酸(W)重復(fù),C端具有一個較保守的IRF關(guān)聯(lián)域,羧基末端具有絲氨酸富含域(serine-rich domain SRD);系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明太平洋鱈IRF7與大西洋鱈IRF7親緣關(guān)系與進(jìn)化關(guān)系最近。通過絕對熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中IPS1的表達(dá)水平結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為:y=-3.2881x+43.399,R2=0.9904;各組織絕對定量結(jié)果顯示脾,腎和胸腺表達(dá)量高于其他組織。實驗根據(jù)采集受精卵時期到33dph時期的太平洋鱈仔魚,應(yīng)用絕對熒光定量PCR方法,以分析仔魚期太平洋鱈TLR3,MDA5,IPS1,IRF3,IRF7的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示,TLR3,IRF3,IRF7均在25dph階段表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào),TLR3,MDA5,IPS1均在1dph階段表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào),其他階段各基因表達(dá)穩(wěn)定,這表明1dph和25dph是太平洋鱈免疫關(guān)鍵時段,干擾素對病害的防治起到重要作用。實驗通過Poly(I:C)對2dph和12dph仔魚進(jìn)行浸泡,并采集3H,6H,12H,24H,48H,72H階段仔魚,應(yīng)用相對定量PCR方法,以分析太平洋鱈仔魚TLR3,MDA5,IPS1,ATG5,IRF3,IRF7在Poly(I:C)誘導(dǎo)下的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示,太平洋鱈仔魚TLR3,MDA5,IPS1,ATG5,IRF3,IRF7在經(jīng)Poly(I:C)處理后出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)表達(dá),多在48H和72H階段表達(dá)量達(dá)到最大值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
，

本文編號：2444025