【摘要】：三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我國特有的淡水育珠蚌,所產(chǎn)淡水珍珠產(chǎn)量占珍珠總量的80%,在珍珠產(chǎn)業(yè)中占有非常重要的地位。三角帆蚌貝殼和珍珠都是碳酸鈣生物礦化的產(chǎn)物,形成碳酸鈣結(jié)晶產(chǎn)物的生物礦化過程是在一系列基質(zhì)蛋白的指導和調(diào)控下進行的。鑒定基質(zhì)蛋白以及探究它們的生物礦化功能對理解貝殼和珍珠的形成機理具有重要的意義。有關(guān)貝殼基質(zhì)蛋白的研究大多集中于海水貝類,淡水貝類殼基質(zhì)蛋白的報道較少。為了更深入地探究三角帆蚌貝殼和珍珠形成的機理,本研究從三角帆蚌外套膜中鑒定出兩個新的貝殼基質(zhì)蛋白基因,hic31和hic52,并對其結(jié)構(gòu)和功能進行了初步研究。1.三角帆蚌hic31基因的克隆和表達分析從三角帆蚌外套膜中克隆得到了hic31基因,對其進行了序列和結(jié)構(gòu)、組織表達分析及原位雜交檢測。利用RACE技術(shù),獲得hic31基因的cDNA序列全長為1432bp,開放閱讀框為957bp,共編碼318個氨基酸,其中1-18個氨基酸為信號肽,去除信號肽后理論分子量28.82 kDa,等電點為7.00,為一中性基質(zhì)蛋白。hic31蛋白的氨基酸序列富含甘氨酸(Gly),占氨基酸總數(shù)的26.67%,且Gly在N端常聚集在一起,以(Gly)n(n=3-7)的形式,形成4個甘氨酸聚集簇。Met/Ser常伴隨甘氨酸聚集簇,在序列中形成(Gly)m X(Gly)n(m1,n1,X指的是Met/Ser)重復片段。hic31蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以α-helix為主,其高級結(jié)構(gòu)預測為一細絲狀的蛋白質(zhì),并與膠原蛋白Type I,α1和α2具有結(jié)構(gòu)相似性,同時,通過熒光定量和原位雜交發(fā)現(xiàn),hic31基因特異地表達于三角帆蚌外套膜,且在外套膜中邊緣膜中的表達量明顯高于緣膜部和中央膜,而且原位雜交檢測時僅在外套膜邊緣膜外上皮細胞中檢測有強烈信號,表明hic31蛋白是一個棱柱層基質(zhì)蛋白,很可能是作為一個框架蛋白參與棱柱層的礦化。2.三角帆蚌hic52基因的克隆和表達分析從三角帆蚌外套膜中克隆得到了hic52基因,并對hic52基因進行了序列和結(jié)構(gòu)、表達分析。結(jié)果顯示,hic52基因的cDNA全長序列為2053bp,ORF為1629bp,共編碼543個氨基酸。其中信號肽為前18個氨基酸,除去信號肽,預測的理論分子量52.2kDa,等電點為10.37,為一堿性蛋白。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn),hic52蛋白是由大量的Gly(28.8%)和Gln(12.4%)組成,在序列中呈現(xiàn)出高頻率的重復片段的特點:(1)Gly主要在N端形成多個甘氨酸簇(Gly)n(n2);(2)Gln和Asn主要分布在序列中間和C端,并且存在兩個特別的重復區(qū)域,即(Gln)2Asn(Gln)4(Asn)2和(Gln)4Asn(Gln)4(Asn)2;(3)在序列中間存在2個連續(xù)的Thr-Ser-Pro、2個對稱連續(xù)的Thr-Asn-Gln重復片段、2個Gly-Gln-X-Gly-Asn-Gly-Gln重復片段(X指的是Gln和Glu);(4)在C端,存在(Gly-X-Gly-Y)n重復片段,其中X,Y為M/S/Q/G/F/I/N。所有這些基序都很有可能與鈣結(jié)合或者與晶體相互作用相關(guān)。二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)hic52蛋白在C端含有一個由29個氨基酸組成的長α-螺旋結(jié)構(gòu),且hic52蛋白的高級結(jié)構(gòu)也與膠原蛋白Type I,alpha 1和alpha 2的呈現(xiàn)一定程度的結(jié)構(gòu)相似性。組織表達分析發(fā)現(xiàn),hic52基因特異地表達于三角帆蚌外套膜,且在外套膜中,中央膜的表達量最高。原位雜交時在外套膜背部中央膜部分外上皮細胞中檢測到了強烈的信號,綜合分析可以推出,hic52蛋白主要是一個與珍珠層形成相關(guān)的基質(zhì)蛋白。3.hic31基因和hic52基因在珍珠形成過程中的功能研究設(shè)計插片實驗并結(jié)合光學顯微鏡研究hic31基因和hic52基因在貝殼和珍珠生物礦化中的功能。通過選取健康規(guī)格一致的三角帆蚌個體進行無核珍珠插核手術(shù),定期進行珍珠囊組織取樣用于后期熒光定量分析,以及收集珍珠小顆粒用于后期光學顯微鏡下觀察表面形貌。熒光定量結(jié)果表明,hic31基因在珍珠囊發(fā)育至23天前表達量上升迅速,而在23天后表達量下降明顯;而hic52基因則是在珍珠囊發(fā)育12天前表達一直保持很低水平,在12-23天之間表達量稍有升高,而在23天之后,hic52基因的表達量上升十分明顯,直至77天觀察到該基因處于低表達狀態(tài)。而光學顯微鏡觀察表明,珍珠顆粒發(fā)育到23天首次明顯觀察到珍珠光澤。因此,結(jié)合珍珠囊發(fā)育不同時期基因的表達規(guī)律與珍珠小顆粒的光學顯微鏡觀察結(jié)果,可以進一步證明hic31蛋白主要是負責棱柱層礦化,而hic52蛋白則主要是參與珍珠層的礦化,因而更好地證明了兩個蛋白在珍珠形成和生物礦化過程各自發(fā)揮的不同功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐在寬;;三角帆蚌對化學物質(zhì)刺激的行為反應(yīng)[J];海洋湖沼通報;2006年02期

2 許巧情;張佩林;;養(yǎng)殖三角帆蚌死亡原因分析[J];中國水產(chǎn);2006年09期

3 葛熹凱;郭小澤;;淺談三角帆蚌的疾病及其防治[J];北京水產(chǎn);2007年03期

4 徐在寬;葛家春;潘建林;許志強;郝忱;;三角帆蚌篩選及其產(chǎn)珠量分析[J];漁業(yè)現(xiàn)代化;2008年03期

5 劉洪波;尤洋;戈賢平;楊健;;池塘養(yǎng)殖及野外移殖三角帆蚌元素積累的差異[J];生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學報;2009年02期

6 楊品紅;王志陶;于楊;王曉艷;謝春華;張倩;李夢軍;;育珠對三角帆蚌形態(tài)學影響的初步研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2010年35期

7 許巧情;李景;;三角帆蚌年齡與培育珍珠產(chǎn)量和質(zhì)量比較[J];科學養(yǎng)魚;2010年08期

8 喬德亮;曾曉雄;;三角帆蚌多糖制備及基本理化性質(zhì)[J];食品與生物技術(shù)學報;2011年01期

9 ;三角帆蚌繁殖的若干技術(shù)UO楲[J];淡水漁業(yè);1974年01期

10 陳順慈;;高密度培育二齡三角帆蚌的試驗[J];水產(chǎn)科技情報;1982年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 徐在寬;;三角帆蚌對化學物質(zhì)刺激的行為反應(yīng)[A];貝類學會第七次會員代表大會暨第十一次學術(shù)討論會摘要[C];2003年

2 袁一鳴;;三角帆蚌金屬硫蛋白基因的克隆及序列分析[A];中國動物學會、中國海洋湖沼學會貝類學會分會第十四次學會研討會論文摘要匯編[C];2009年

3 沈文英;李衛(wèi)芬;徐正海;;益生菌對三角帆蚌生長和免疫酶活性的影響[A];全國畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖污染監(jiān)測與控制治理技術(shù)交流研討會論文集[C];2008年

4 龔惠卿;陸永娟;;微量元素對三角帆蚌成活率影響的初步研究[A];中國動物學會、中國海洋湖沼學會貝類學分會第二次代表會暨第三次學術(shù)討論會論文集[C];1986年

5 肖調(diào)義;葛熹凱;許寶紅;蘇建明;章懷云;;三角帆蚌肝臟抑制性消減cDNA文庫的構(gòu)建與分析[A];2008年中國水產(chǎn)學會學術(shù)年會論文摘要集[C];2008年

6 付龍龍;李家樂;白志毅;趙永超;;四種物理標記對三角帆蚌生長、存活的影響[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學會學術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

7 肖調(diào)義;劉巧林;郭小澤;章懷云;崔樹良;;三角帆蚌細胞色素P450基因的克隆與表達分析[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學會學術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

8 任崗;王巖;;三角帆蚌鈣調(diào)素及其類似蛋白的基因克隆和表達分析[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學會學術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

9 吳圣楠;劉大偉;劉毅;胡寶慶;張建強;王艷;;三角帆蚌熱休克蛋白60基因克隆及其表達分析[A];中國水產(chǎn)學會魚病專業(yè)委員會2013年學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2013年

10 張根芳;王旦旦;方愛萍;;懷卵期三角帆蚌(Hgriopsis Cumingii)外側(cè)瓣鰓的組織學觀察[A];中國海洋湖沼學會中國動物學會貝類學分會第十二次學術(shù)討論會摘要[C];2005年

相關(guān)重要報紙文章 前7條

1 浙江省蘭溪市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 程志良;青魚三角帆蚌混養(yǎng)試驗[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報;2009年

2 周一帆;病毒性蚌瘟的防治[N];中國漁業(yè)報;2013年

3 傅劍夫;撫州加快池蝶蚌產(chǎn)業(yè)化[N];中國漁業(yè)報;2005年

4 石巖;新技術(shù)讓珍珠熠熠生輝[N];科技日報;2006年

5 徐毛喜;池蝶蚌育珠技術(shù)[N];中國漁業(yè)報;2005年

6 記者 徐瑞哲;“混血蚌”：珍珠產(chǎn)得大又多[N];解放日報;2009年

7 紹興文理學院;充分發(fā)揮科技優(yōu)勢 服務(wù)區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展[N];紹興日報;2006年

相關(guān)博士學位論文 前7條

1 鄭漢豐;三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組分析與珍珠質(zhì)量相關(guān)基因初步研究[D];上海海洋大學;2015年

2 喬德亮;三角帆蚌多糖提取、純化、生物活性及其結(jié)構(gòu)[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2009年

3 楊子彥;三角帆蚌肽聚糖識別蛋白和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的基因克隆和功能分析[D];華中科技大學;2013年

4 金武;三角帆蚌生長性狀與育珠性狀的遺傳參數(shù)估計[D];上海海洋大學;2012年

5 鐘蕾;三角帆蚌細菌性瘟病病原學研究與LasB基因的克隆及表達[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2011年

6 任崗;環(huán)境鈣離子濃度影響三角帆蚌珍珠質(zhì)形成的生物礦化機理研究[D];浙江大學;2013年

7 張剛生;珍珠層的微結(jié)構(gòu)及其中類胡蘿卜素的原位研究[D];中國科學院廣州地球化學研究所;2001年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 袁曉泉;池蝶蚌與三角帆蚌育珠性能比較研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2008年

2 王曉艷;影響三角帆蚌育珠效果關(guān)鍵因子研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2011年

3 曾仕梅;三角帆蚌貝殼基質(zhì)蛋白基因hic31和hic52的鑒定及其生物礦化功能研究[D];上海海洋大學;2016年

4 金參;三角帆蚌貝殼基質(zhì)蛋白基因hic22和hic74的分離鑒定及其功能探究[D];上海海洋大學;2016年

5 徐龍威;三角帆蚌SPI和LBP/BPI基因的分子特征、表達分析及SNP的應(yīng)用研究[D];上海海洋大學;2016年

6 周子睿;鈣離子濃度對三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團細胞內(nèi)鈣含量及碳酸酐酶的影響[D];上海海洋大學;2016年

7 王俊南;三角帆蚌3個免疫相關(guān)基因的分子特征及表達分析[D];上海海洋大學;2016年

8 劉寅初;洞庭湖區(qū)三角帆蚌蚌流行病病原研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2008年

9 葛熹凱;三角帆蚌肝臟消減cDNA文庫的構(gòu)建與分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2008年

10 文祝友;三角帆蚌消化系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)及消化酶特性的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2008年

，

本文編號：2430435