【摘要】：通過構(gòu)建SIK2基因敲除小鼠模型,進(jìn)一步從體內(nèi)研究SIK2蛋白的功能。主要包括SIK2在電離輻射損傷、免疫及免疫損傷修復(fù)和T細(xì)胞抗原受體(TCR)基因重排這幾方面的功能,為SIK2功能的深入研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。構(gòu)建帶有兩個Loxp位點(diǎn)的ES細(xì)胞打靶載體,轉(zhuǎn)染ES,通過同源重組將兩個Loxp位點(diǎn)整合進(jìn)基因組中SIK2基因的第2、3號外顯子兩邊的內(nèi)含子上,篩選帶有兩個Loxp位點(diǎn)的陽性ES克隆,將陽性ES克隆顯微注射囊胚腔內(nèi),隨后移植于假孕雌鼠子宮中,待嵌合體小鼠SIK2LoxPl-2+/-出生,嵌合體小鼠經(jīng)純化后與EⅡα-Cre+/+工具鼠雜交,篩選SIK2Loxp1-2+/-Cre+/-鼠,該小鼠與WT型小鼠雜交,篩選SIK2Loxp3+/-Cre-/-(SIK2+/-)鼠,再將SIK2+/-基因型小鼠雌雄雜交,篩選SIK2-/-基因型小鼠。隨后,利用SIK2+/+(WT)與SIK2+/-(KO)小鼠進(jìn)行功能研究。WT與KO小鼠分別給予8 Gy60Coγ射線一次性全身照射,每天觀察記錄其生長存活情況,并計(jì)算各自在30天內(nèi)的存活率。取SIK2+/-基因型的小鼠雌雄雜交,取孕13.5天雌鼠胚胎分離MEFs細(xì)胞,通過克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察二者的輻射敏感性差異。通過血常規(guī)分析WT與KO小鼠紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及血紅蛋白含量,并進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù),觀察SIK2敲除對造血功能的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測WT與KO小鼠外周血、胸腺、骨髓和脾組織中免疫細(xì)胞的比例數(shù)量,對T、B細(xì)胞亞群進(jìn)行分析,并結(jié)合組織切片HE染色觀察各免疫組織病理結(jié)構(gòu)變化,研究小鼠SIK2基因敲除對其免疫力的影響。取SIK2+/+與SIK2+/-小鼠胸腺組織,提取胸腺細(xì)胞DNA,設(shè)計(jì)針對TCRβ位點(diǎn)Vβ8-Dβ2Jβ2重組片段的特異性探針,通過Southern blot技術(shù)檢測WT與KO小鼠TCRβ位點(diǎn)V(D)J重組是否存在差異。結(jié)果顯示,成功篩選到了陽性ES克隆,通過顯微注射及囊胚移植,獲得了SIK2 LoxPl-2+/-嵌合體小鼠。該嵌合體小鼠經(jīng)純化后與EⅡα-Cre+/+工具鼠雜交,篩選得到SIK2Loxp1-2+/-Cre+/-鼠,該小鼠與WT型小鼠雜交,獲得了SIK2Loxp3+/-Cre-/-(SIK2+/-)鼠,再將SIK2+/-基因型小鼠雌雄雜交,未篩選到SIK2-/-基因型小鼠,由于SIK2敲除后導(dǎo)致胚胎致死。小鼠存活率實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SIK2基因敲除小鼠及MEFs細(xì)胞的輻射敏感性增強(qiáng)。血常規(guī)分析表明KO小鼠紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及血紅蛋白含量均顯著低于WT。骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,KO小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯少于WT。流式結(jié)果表明,KO胸腺中CD4+CD8-、CD4-CD8+T細(xì)胞含量顯著減少,CD4+CD8+T細(xì)胞含量顯著增加;外周血中CD3+T細(xì)胞含量減少,CD4+CD8-、CD4-CD8+T細(xì)胞含量減少,而不成熟的CD4-CD8-T細(xì)胞含量顯著增多;骨髓中IgM+B220+和B220+CD43-B細(xì)胞含量有所減少;脾臟中成熟的CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性T細(xì)胞含量及IgM+B220+B細(xì)胞含量顯著減少。組織切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn),SIK2+/-小鼠胸腺、脾和骨髓的病理組織結(jié)構(gòu)與SIK2+/+相比無顯著改變。但在照射后,SIK2+/-小鼠胸腺、脾和骨髓各項(xiàng)指標(biāo)顯示,其比WT損傷的更為嚴(yán)重,損傷恢復(fù)更加緩慢。最后,我們還發(fā)現(xiàn)SIK2+/-小鼠胸腺細(xì)胞DNA中未能檢測到TCRβ位點(diǎn)V8-D2J2基因片段。實(shí)驗(yàn)表明利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)成功構(gòu)建了SIK2基因敲除小鼠,但暫未得到SIK2-/-完全敲除的小鼠,存在胚胎致死現(xiàn)象。SIK2基因敲除后小鼠及MEFs細(xì)胞的輻射敏感性增強(qiáng);造血功能減弱;小鼠淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟受阻;輻射引起的免疫系統(tǒng)損傷修復(fù)減弱;小鼠TCRβ位點(diǎn)V-DJ基因重排失敗。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2430373