【摘要】：目的研究用慢病毒載體法建立乳腺癌α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3GalⅢ基因RNA干擾(RNAi)的細(xì)胞模型。方法針對ST3GalⅢ基因設(shè)計(jì)4組短發(fā)夾RNA序列,合成DNA與線性化的pGLV3-H1-GFP載體連接,構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒。鑒定后,進(jìn)行病毒包裝和病毒滴度檢測;將獲得的重組慢病毒pGLV3-H1-GFP-shST3轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后,將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為3組:空白組,未轉(zhuǎn)染組(mock cells,M);對照組(轉(zhuǎn)染對照慢病毒,parent cells,P);干擾組,轉(zhuǎn)染慢病毒載體pGLV5-H1-GFP-shST3(shST3-1,2,3,4)。以熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá),經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選;用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot檢測轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞中ST3Gal Ⅲ mRNA及蛋白表達(dá),以流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面α2,3-唾液酸水平。結(jié)果成功構(gòu)建針對ST3GalⅢ基因的RNAi慢病毒載體,病毒懸液滴度均2×10~8TU·mL~(-1)。各轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上;經(jīng)嘌呤霉素篩選后,干擾組的ST3Gal Ⅲ mRNA的抑制率分別為42.1%,66.7%,30.1%,80.9%及蛋白表達(dá)水平分別下降了35.92%,75.64%,37.12%,81.75%。與對照組比較,干擾組細(xì)胞ST3Gal Ⅲ基因的mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);shST3-4組細(xì)胞表面α2,3-唾液酸水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了乳腺癌ST3Gal Ⅲ基因RNAi的細(xì)胞模型shST3-4。
[Abstract]:Objective to establish a human breast cancer cell model in which RNA of 偽 _ 2 and 3-sialic acid transferase ST3Gal 鈪，

本文編號：2427721