【摘要】：基因療法是近年來建立在基因工程技術(shù)和分子遺傳學(xué)原理基礎(chǔ)上的新型治療方法。因腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)是基因突變,相比傳統(tǒng)治療,基因治療是最有可能從根本上根除腫瘤的方法。基因治療涉及三個(gè)環(huán)節(jié),即目的基因、轉(zhuǎn)基因載體和靶細(xì)胞�，F(xiàn)階段尚缺乏理想的轉(zhuǎn)基因載體,由此我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一種新型的非病毒基因載體。首先利用泊洛沙姆P407交聯(lián)低分子量PEI得到分子量較高的PEI衍生物P407-PEI,通過調(diào)整反應(yīng)比得到系列PEI衍生物,選出其中轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞毒性小的聚合物。之后設(shè)計(jì)合成一種能靶向于腫瘤細(xì)胞,并提高核遞送能力的雙功能肽tLyP-1-NLS(命名為K12)。K12包括連接能靶向于腫瘤細(xì)胞表面NRP受體的tLyP-1多肽和可被核膜輸入蛋白識(shí)別的核定位信號(hào)肽NLS。利用交聯(lián)技術(shù)將P407-PEI與K12偶聯(lián),合成新型非病毒基因載體P407-PEI-K12。最后,P407-PEI-K12與DNA自裝配成納米復(fù)合物,通過添加游離的泊洛沙姆P407形成溫敏性緩釋水凝膠,為基因治療探索有效途徑。第一部分,探討了聚乙烯亞胺以及泊洛沙姆嵌段共聚物和功能肽用于非病毒基因載體的研究現(xiàn)狀,在基因載體的應(yīng)用中存在的主要問題,并討論了可能的優(yōu)化策略。第二部分,P407-PEI-K12的合成及表征。第一步采用固相Fmoc法合成雙功能肽K12,K12由tLyP-1肽、NLS兩個(gè)短肽連接而成,具有腫瘤靶向性和提高核遞送能力的特點(diǎn)。合成雙功能肽K12后,MS分析鑒定序列與設(shè)計(jì)序列一致,HPLC測(cè)定含量為98.75%,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)投料要求。第二步使用細(xì)胞毒性較低的泊洛沙姆P407連接不同比例的低分子量PEI,得到中間產(chǎn)物P407-PEI。最后,K12肽與P407-PEI通過SMCC法偶聯(lián),得到最終聚合物P407-PEI-K12。將合成好的產(chǎn)物與初產(chǎn)物進(jìn)行1H-NMR檢測(cè),通過對(duì)比分析說明雙功能肽K12已與P407-PEI相連形成P407-PEI-K12。第三部分,考察了P407-PEI-K12的理化性質(zhì)。第一步,驗(yàn)證出其具有良好的pH緩沖和水解能力。第二步,通過儀器檢測(cè)得出P407-PEI-K12/DNA復(fù)合物粒徑都在200-500 nm之間,Zeta電位處于5-35 mV之間,適合在體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)。第三步,通過凝膠實(shí)驗(yàn)考察得出聚合物P407-PEI-K12-h和P407-PEI-K12-l可以有效包合DNA。第四步,模擬體內(nèi)環(huán)境,考查了聚合物對(duì)DNA的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)表明,P407-PEI-K12可保護(hù)DNA抵抗大于63 U DNase I/?g DNA、50%血清和大約600?g/mL肝素鈉的降解,且對(duì)B16細(xì)胞的細(xì)胞毒性相對(duì)較低。具備一個(gè)符合條件的基因傳遞體的基本要求,有進(jìn)一步研究的價(jià)值。第四部分,體外考察P407-PEI-K12/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率以及基于P407的溫敏型凝膠緩釋性能。第一步分別定性和定量考察復(fù)合物對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染并評(píng)價(jià)聚合物的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明,在P407交聯(lián)PEI后,轉(zhuǎn)染效率有所提高,其中P407-10g-PEI最高;在P407-10g-PEI上偶聯(lián)功能肽K12后,可提高復(fù)合物腫瘤靶向性并協(xié)助載體更好的穿過細(xì)胞核膜,進(jìn)入細(xì)胞核;游離泊洛沙姆P407的加入在一定范圍內(nèi)可以提高P407-PEI-K12轉(zhuǎn)染效率,當(dāng)添加的量達(dá)到0.09%時(shí),促進(jìn)轉(zhuǎn)染作用最強(qiáng)。第二步考察了泊洛沙姆P407溫敏型凝膠的相關(guān)理化性質(zhì):一定濃度游離泊洛沙姆P407溶液在溫度升高到37℃下可以形成穩(wěn)定凝膠,質(zhì)地均勻細(xì)膩、透明,有一定彈性和粘性,穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。第三步,P407-PEI-K12-h和P407-PEI-K12-l分別與pGL3-Control自裝配成納米復(fù)合物,通過添加游離泊洛沙姆P407為藥物緩釋載體,形成緩釋水凝膠。以PEI 2 KDa為對(duì)照,評(píng)價(jià)P407-PEI-K12/pGL3-Control復(fù)合物緩釋水凝膠的釋放液體的轉(zhuǎn)染功能。結(jié)果表明,復(fù)合物緩釋水凝膠溶蝕液體具有轉(zhuǎn)染功能,凝膠在水解過程中,不斷放出復(fù)合物可以獲得持續(xù)基因表達(dá),隨之溶解的游離泊洛沙姆P407可以增加復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)而提高腫瘤的基因治療效果。本課題通過基團(tuán)修飾的方法,合成聚合物P407-PEI-K12以期解決PEI作為基因載體使用中的不足。在增加其靶向性和核遞送能力情況下,載體自身細(xì)胞毒性依然較低。通過添加游離的泊洛沙姆P407形成溫敏型緩釋水凝膠。凝膠在水解過程中,不斷釋放復(fù)合物可以獲得持續(xù)基因表達(dá)。隨之溶解的游離泊洛沙姆P407在一定濃度范圍內(nèi)可以增加復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率,起到持續(xù)高效遞送基因的作用,為基因治療探索有效途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R450

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2427709