【摘要】：基因療法是近年來建立在基因工程技術(shù)和分子遺傳學原理基礎(chǔ)上的新型治療方法。因腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學基礎(chǔ)是基因突變,相比傳統(tǒng)治療,基因治療是最有可能從根本上根除腫瘤的方法�；蛑委熒婕叭齻�環(huán)節(jié),即目的基因、轉(zhuǎn)基因載體和靶細胞�，F(xiàn)階段尚缺乏理想的轉(zhuǎn)基因載體,由此我們設計合成了一種新型的非病毒基因載體。首先利用泊洛沙姆P407交聯(lián)低分子量PEI得到分子量較高的PEI衍生物P407-PEI,通過調(diào)整反應比得到系列PEI衍生物,選出其中轉(zhuǎn)染效率高且細胞毒性小的聚合物。之后設計合成一種能靶向于腫瘤細胞,并提高核遞送能力的雙功能肽tLyP-1-NLS(命名為K12)。K12包括連接能靶向于腫瘤細胞表面NRP受體的tLyP-1多肽和可被核膜輸入蛋白識別的核定位信號肽NLS。利用交聯(lián)技術(shù)將P407-PEI與K12偶聯(lián),合成新型非病毒基因載體P407-PEI-K12。最后,P407-PEI-K12與DNA自裝配成納米復合物,通過添加游離的泊洛沙姆P407形成溫敏性緩釋水凝膠,為基因治療探索有效途徑。第一部分,探討了聚乙烯亞胺以及泊洛沙姆嵌段共聚物和功能肽用于非病毒基因載體的研究現(xiàn)狀,在基因載體的應用中存在的主要問題,并討論了可能的優(yōu)化策略。第二部分,P407-PEI-K12的合成及表征。第一步采用固相Fmoc法合成雙功能肽K12,K12由tLyP-1肽、NLS兩個短肽連接而成,具有腫瘤靶向性和提高核遞送能力的特點。合成雙功能肽K12后,MS分析鑒定序列與設計序列一致,HPLC測定含量為98.75%,符合后續(xù)實驗投料要求。第二步使用細胞毒性較低的泊洛沙姆P407連接不同比例的低分子量PEI,得到中間產(chǎn)物P407-PEI。最后,K12肽與P407-PEI通過SMCC法偶聯(lián),得到最終聚合物P407-PEI-K12。將合成好的產(chǎn)物與初產(chǎn)物進行1H-NMR檢測,通過對比分析說明雙功能肽K12已與P407-PEI相連形成P407-PEI-K12。第三部分,考察了P407-PEI-K12的理化性質(zhì)。第一步,驗證出其具有良好的pH緩沖和水解能力。第二步,通過儀器檢測得出P407-PEI-K12/DNA復合物粒徑都在200-500 nm之間,Zeta電位處于5-35 mV之間,適合在體內(nèi)運轉(zhuǎn)。第三步,通過凝膠實驗考察得出聚合物P407-PEI-K12-h和P407-PEI-K12-l可以有效包合DNA。第四步,模擬體內(nèi)環(huán)境,考查了聚合物對DNA的保護作用。實驗表明,P407-PEI-K12可保護DNA抵抗大于63 U DNase I/?g DNA、50%血清和大約600?g/mL肝素鈉的降解,且對B16細胞的細胞毒性相對較低。具備一個符合條件的基因傳遞體的基本要求,有進一步研究的價值。第四部分,體外考察P407-PEI-K12/DNA復合物的轉(zhuǎn)染效率以及基于P407的溫敏型凝膠緩釋性能。第一步分別定性和定量考察復合物對目標細胞的轉(zhuǎn)染并評價聚合物的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明,在P407交聯(lián)PEI后,轉(zhuǎn)染效率有所提高,其中P407-10g-PEI最高;在P407-10g-PEI上偶聯(lián)功能肽K12后,可提高復合物腫瘤靶向性并協(xié)助載體更好的穿過細胞核膜,進入細胞核;游離泊洛沙姆P407的加入在一定范圍內(nèi)可以提高P407-PEI-K12轉(zhuǎn)染效率,當添加的量達到0.09%時,促進轉(zhuǎn)染作用最強。第二步考察了泊洛沙姆P407溫敏型凝膠的相關(guān)理化性質(zhì):一定濃度游離泊洛沙姆P407溶液在溫度升高到37℃下可以形成穩(wěn)定凝膠,質(zhì)地均勻細膩、透明,有一定彈性和粘性,穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。第三步,P407-PEI-K12-h和P407-PEI-K12-l分別與pGL3-Control自裝配成納米復合物,通過添加游離泊洛沙姆P407為藥物緩釋載體,形成緩釋水凝膠。以PEI 2 KDa為對照,評價P407-PEI-K12/pGL3-Control復合物緩釋水凝膠的釋放液體的轉(zhuǎn)染功能。結(jié)果表明,復合物緩釋水凝膠溶蝕液體具有轉(zhuǎn)染功能,凝膠在水解過程中,不斷放出復合物可以獲得持續(xù)基因表達,隨之溶解的游離泊洛沙姆P407可以增加復合物轉(zhuǎn)染效率,進而提高腫瘤的基因治療效果。本課題通過基團修飾的方法,合成聚合物P407-PEI-K12以期解決PEI作為基因載體使用中的不足。在增加其靶向性和核遞送能力情況下,載體自身細胞毒性依然較低。通過添加游離的泊洛沙姆P407形成溫敏型緩釋水凝膠。凝膠在水解過程中,不斷釋放復合物可以獲得持續(xù)基因表達。隨之溶解的游離泊洛沙姆P407在一定濃度范圍內(nèi)可以增加復合物轉(zhuǎn)染效率,起到持續(xù)高效遞送基因的作用,為基因治療探索有效途徑。
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【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R450

【參考文獻】

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本文編號：2427709