【摘要】：【目的】植物激素乙烯參與植物的生長發(fā)育以及生物與非生物脅迫過程。組成型三重反應(yīng)基因CTR1作為乙烯受體下游一個負調(diào)控因子,結(jié)合乙烯受體共同參與乙烯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究通過對大豆(Glycine max)的組成型三重反應(yīng)基因CTR1進行克隆和誘導(dǎo)表達分析,以及在大豆發(fā)狀根中過表達該基因后進行疫霉根腐病的抗性分析,探究CTR1在大豆與疫霉菌互作過程中的功能。【方法】利用同源克隆的方法,以擬南芥的AtCTR1序列為探針,在大豆基因組數(shù)據(jù)庫中搜索同源性最高的基因即為大豆的GmCTR1(Glyma.13G151100),并從Williams82中將GmCTR1克隆出來。對GmCTR1進行多重序列比對、系統(tǒng)進化分析和疫霉菌的誘導(dǎo)表達分析。構(gòu)建植物過表達載體p Bin GFP2:GmCTR1。應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得大豆發(fā)狀根,經(jīng)GFP熒光篩選得到大豆過表達GmCTR1的陽性發(fā)狀根和轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的陰性對照發(fā)狀根。對過表達GmCTR1發(fā)狀根和陰性對照發(fā)狀根侵染疫霉菌后,檢測病斑長度、疫霉生物量和抗性相關(guān)基因的表達。【結(jié)果】根據(jù)同源序列比對結(jié)果,將與擬南芥At CTR1(AT5G03730)同源性最高(75.3%)的大豆基因Glyma.13G151100命名為GmCTR1,從Williams82中克隆得到GmCTR1的CDS序列。該基因的CDS序列全長2 511 bp,編碼836個氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,蛋白質(zhì)量為92.35 k D,等電點為6.51。多重序列比對結(jié)果顯示,GmCTR1氨基酸具有CTR1同源蛋白的典型結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵特征。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行進化分析發(fā)現(xiàn),GmCTR1與菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的CTR1親緣關(guān)系十分相近,在同一個分支上,且與菜豆的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR結(jié)果表明,在大豆疫霉菌P6497侵染后,GmCTR1受誘導(dǎo)逐漸上調(diào)表達,在侵染48 h后表達水平達到最高,隨后表達量降低。利用酶切連接方法將GmCTR1的CDS序列構(gòu)建到植物過表達載體p Bin GFP2中,PCR和酶切驗證獲得了重組質(zhì)粒p Bin GFP2:GmCTR1。對發(fā)狀根接種疫霉菌后發(fā)現(xiàn),過表達GmCTR1減弱了對疫霉根腐病的抗性,疫霉菌侵染36 h后過表達發(fā)狀根與對照相比病斑長度顯著增長。過表達GmCTR1發(fā)狀根中疫霉菌的生物量與對照相比增加,與大豆抗病反應(yīng)相關(guān)基因的表達水平顯著降低。【結(jié)論】GmCTR1在大豆與疫霉菌的互作過程中發(fā)揮一定的負調(diào)控作用。
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【作者單位】： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家大豆改良中心/農(nóng)業(yè)部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室;
【基金】：國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303018) 轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2011ZX08004) 長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(PCSIRT13073) 大豆現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-004-PS10) 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心
【分類號】：S565.1
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本文編號：2427592