【摘要】：基因治療需要開發(fā)高效、安全的載體系統(tǒng),用于運載DNA或siRNA至目標組織。陽離子脂質(zhì)體作為一類重要的非病毒載體,具有容易制備,重現(xiàn)性好,無免疫原性,能與大分子DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物等優(yōu)勢。本文以半乳糖為原料,合成了兩類陽離子脂質(zhì)體,第一類經(jīng)過全乙�；�、脫1-O-乙�；�、三氯乙酰亞胺酯化、糖苷化、疊氮化、脫乙�；Ｗo、3,4-O-異丙叉基保護、醚化、脫異丙叉基、還原胺化和季銨鹽化反應(yīng),合成不同長度疏水鏈連在糖環(huán)氧原子上的半乳糖衍生物陽離子脂質(zhì)體:di-C12-Gal-TMA,di-C14-Gal-TMA,di-C16-Gal-TMA,di-C18-Gal-TMA;第二類經(jīng)過全乙�；⒚�1-O-乙�；�、三氯乙酰亞胺酯化、糖苷化、疊氮化、脫乙�；Ｗo、還原氨化、叔胺化、季銨鹽化反應(yīng),合成不同長度疏水鏈連在季銨鹽頭部氮原子上的半乳糖衍生物陽離子脂質(zhì)體:Gal-DiC12MA,Gal-DiC14MA,Gal-DiC16MA,Gal-DiC18MA。采用馬爾文激光粒度儀測定陽離子脂質(zhì)體及其DNA復(fù)合物的Zeta電位、平均粒徑、PDI。結(jié)果顯示:陽離子脂質(zhì)體的Zeta電位在50-70 mv之間;平均粒徑在130-245 nm之間,分布均勻;脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物Zeta電位隨著N/P的增大而增大,第一類脂質(zhì)體復(fù)合物在N/P大于4時達到正值,第二類脂質(zhì)體復(fù)合物在N/P為2時就已為正值;除了di-C18-Gal-TMA/DNA,Gal-DiC18MA/DNA在低N/P時,平均粒徑為300-450 nm,其余復(fù)合物的平均粒徑在100-250 nm之間。用原子力顯微鏡表征陽離子脂質(zhì)體及其DNA復(fù)合物的表面形貌,顯示所有陽離子脂質(zhì)體及其DNA復(fù)合物都呈球形,分散均勻。通過凝膠阻滯實驗探究脂質(zhì)體與DNA的結(jié)合能力,隨著N/P的增大DNA在凝膠中的阻滯作用增強,除了di-C18-Gal-TMA,其余脂質(zhì)體在N/P達到2時DNA已被結(jié)合完全。以Lipo2000作陽性對照,分別檢測陽離子脂質(zhì)體攜帶DNA在PC-3,HEK293,HepG2,Mat,Hela,SW480,A375,7721細胞內(nèi)的表達效果,以及陽離子脂質(zhì)體攜帶siRNA在PC-3、Mat細胞中的基因沉默效果。結(jié)果表明:di-C16-Gal-TMA/DNA在PC-3,Mat,Hela細胞中有較好的表達效果;而Gal-DiC16MA/DNA在HEK293,HepG2細胞中有較好的表達效果;di-C16-Gal-TMA/siRNA和Gal-DiC16MA/siRNA在PC-3,Mat細胞中都有較好的基因沉默效果。同時細胞毒性實驗表明di-C16-Gal-TMA,Gal-DiC16MA在PC-3,HEK293,Hep G2,Mat,Hela五種細胞中的細胞毒性都較低。因此值得對di-C16-Gal-TMA,Gal-DiC16MA做更進一步的研究。
[Abstract]:Gene therapy requires the development of efficient and safe vector systems for carrying DNA or siRNA to target tissues. As a kind of important non-viral carrier, cationic liposomes have the advantages of easy preparation, good reproducibility, no immunogenicity, and the ability to form stable complexes with macromolecular DNA. In this paper, two kinds of cationic liposomes were synthesized from galactose. The first kind of liposomes were completely acetylated, deacetylated, trichloroimide esterified, glycosylated, azide, deacetylated, and 34-Oisopropylidene protected. The cationic liposomes of galactose derivatives were synthesized by etherification, deisopropyl group, reductive amination and quaternary ammonium salinization. The cationic liposomes of galactose derivatives with different lengths of hydrophobic chain were synthesized on glycosyl epoxy atom: di-C12-Gal-TMA,di-C14-Gal-TMA,di-C16-Gal-TMA, Di-C18-Gal-TMA; The second type is completely acetylated, deacetylated, esterified with trichloroimide, glycoside, azide, deacetylation, reductive ammoniation, tertiary amination, quaternary ammonium salinization, Synthesis of galactose Derivatives Cationic Liposomes with different length hydrophobic chains attached to nitrogen Atom of Quaternary ammonium Salt head: Gal-DiC12MA,Gal-DiC14MA,Gal-DiC16MA,Gal-DiC18MA. Determination of Zeta potential, mean particle size, PDI. of cationic liposomes and their DNA complexes by Ma Erwen laser particle size analyzer The results showed that the Zeta potential of cationic liposomes ranged from 50 to 70 mv and the average particle size ranged from 130 to 245 nm. The Zeta potential of liposome / DNA complex increases with the increase of N / P, the first type of liposome complex reaches positive value when N / P is greater than 4, and the second type of liposome complex is positive when N / P is 2. With the exception of di-C18-Gal-TMA/DNA,Gal-DiC18MA/DNA at low N / P, the average particle size of the complexes ranged from 300-450 nm, to 100-250 nm. The surface morphology of cationic liposomes and their DNA complexes was characterized by atomic force microscopy. The results showed that all cationic liposomes and their DNA complexes were spherical and uniformly dispersed. The binding ability of liposome to DNA was investigated by gel blocking experiment. With the increase of N / P, the blocking effect of DNA in gel was enhanced, and the other liposomes, except di-C18-Gal-TMA, had been completely bound at 2 DNA at N / P level. The effect of cationic liposome carrying DNA in PC-3,HEK293,HepG2,Mat,Hela,SW480,A375,7721 cells and the gene silencing effect of cationic liposome carrying siRNA in PC-3,Mat cells were detected by using Lipo2000 as positive control. The results showed that the expression of di-C16-Gal-TMA/DNA in PC-3,Mat,Hela cells was better than that of Gal-DiC16MA/DNA in HEK293,HepG2 cells. Both di-C16-Gal-TMA/siRNA and Gal-DiC16MA/siRNA have good gene silencing effect in PC-3,Mat cells. At the same time, the cytotoxicity of di-C16-Gal-TMA,Gal-DiC16MA in PC-3,HEK293,Hep G _ (2) T _ (2) H _ (2) was lower. Therefore, it is worth doing further research on di-C16-Gal-TMA,Gal-DiC16MA.
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q789

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本文編號：2419972