發(fā)布時間：2019-01-08 13:14

【摘要】：哺乳動物精子受精前需要在雌性生殖道內停留一段時間,期間精子的形態(tài)和生理會發(fā)生必要的變化,這樣精子就會具備受精所需的能力,這個過程稱之為獲能。精子及時獲能和產生頂體反應在自然受精過程中很重要,同樣維持精子在受精前未獲能狀態(tài)也非常關鍵。時至今日,我們對哺乳動物精子獲能的機制雖然研究甚多但是未知依舊很多。PLCζ在生殖發(fā)育中意義重大,其對精子的發(fā)生發(fā)育及卵母細胞激活等相關研究日益成為生殖發(fā)育的研究熱點。PLCζ家族中的睪丸發(fā)育特異性蛋白-27 基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27),被認為是一種新的精子內源性去能因子,目前已證實NYD-SP27在人類和小鼠精子獲能上具有重要作用,但NYD-SP27在綿羊精子獲能中的作用未見相關報道。本研究基于克隆綿羊NYD-SP27基因,探究該蛋白的表達特性,篩選高效的干擾片段,為揭示NYD-SP27在綿羊精子發(fā)生及獲能中的作用機制提供一定的科學依據。[目的]本研究通過構建綿羊NYD-SP27基因的哺乳動物真核表達載體,構建穩(wěn)定表達NYD-SP27蛋白的BHK-21細胞系,構建和篩選慢病毒干擾載體,為之后研究NYD-SP27表達上調、下調對綿羊精子發(fā)生及獲能的影響提供相應的分子工具。[方法]從綿羊睪丸組織提取RNA,反轉錄后克隆綿羊NYD-SP27基因,擴增出P2A-Flag-NYDSP片段,并將其插入到真核表達載體pDsRed1-C1中,利用豬捷申病毒2A肽(P2A)將該蛋白和紅色熒光蛋白連接以實現共表達,將重組質粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP轉染至BHK-21細胞,轉染24小時后熒光顯微鏡觀察轉染效果,然后用G418篩選獲得穩(wěn)定轉基因細胞株,利用基因組DNA進行 PCR 擴增、RT-PCR 擴增、間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot對NYD-SP27基因的表達進行鑒定。將培養(yǎng)20代后的穩(wěn)定細胞系BHK-SP27-21與正常BHK-21細胞比較形態(tài)和生長速度。針對綿羊NYD-SP27基因的序列,設計干擾NYD-SP27的短發(fā)卡RNA和陰性對照干擾RNA,并克隆至病毒干擾載體上,構建干擾綿羊NYD-SP27基因的慢病毒干擾載體PLL3.7-NYDSP-shRNA。將慢病毒干擾載體與包裝質粒(VSVG、pMDL和REV)共轉染HEK-293FT細胞,進行慢病毒包裝,之后測定滴度,用慢病毒感染靶細胞BHK-SP27-21,利用熒光實時定量PCR檢測目的基因的擴增,分析干擾效率,進而篩選出干擾效率高的干擾片段。[結果]擴增出綿羊NYD-SP27基因,經過測序比對,大小為1617bp,成功將P2A和Flag標簽引入目的基因片段,成功構建了綿羊NYD-SP27的真核表達載體�；蚪MPCR和RT-PCR均能擴增出1617bp的特異性條帶,結果表明,NYD-SP27基因穩(wěn)定整合至宿主細胞基因組,IFA的結果顯示實驗組陽性細胞上可觀察到綠色熒光,而陰性對照沒有熒光。Western blot結果說明NYD-SP27蛋白能夠在BHK-21細胞中正常表達,分子大小約為63 kDa,和預期結果一致,這樣的大小也表明在NYD-SP27蛋白和紅色熒光蛋白翻譯過程中,P2A成功自我剪切,同時表明本實驗構建的穩(wěn)定細胞系正確。共設計4條干擾NYD-SP27的短發(fā)卡RNA和1條陰性對照RNA,并成功構建了相對應的干擾慢病毒載體,繼而分別與輔助質粒一起包裝出干擾慢病毒NYD-SP27 NYDSP-shRNA-LV,使用熒光實時定量PCR成功篩選出干擾效率較高的干擾片段NYDSP-shRNA-3。[結論]成功克隆出了綿羊NYD-SP27基因,構建了重組真核表達質粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP,為后續(xù)試驗提供了材料。成功建立了穩(wěn)定表達綿羊NYD-SP27基因的BHK-21細胞系,將其命名為BHK-SP27-21細胞。成功篩選出干擾效率較高的干擾載體NYDSP-shRNA-1,并能顯著降低綿羊NYD-SP27基因mRNA的表達量。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;S826

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