【摘要】：背景和目的:人類棘皮動物微管相關蛋白樣4和人類間變性淋巴瘤激酶融合基因EML4-ALK是新發(fā)現(xiàn)的非小細胞肺癌的驅動基因,具有獨特的臨床病理生理特征。ALK基因下游信號通路的異常持續(xù)激活是其重要的下游信號通路,而導致其下游基因持續(xù)激活的原因不明。細胞因子信號轉導抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)是一類在細胞信號轉導過程中起重要作用的負調控因子,主要通過抑制JAK蛋白酪氨酸激酶(janus protein tyrosine kinase,JAK激酶)信號傳導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)即JAK-STAT等信號通路來調控細胞的增殖、分化和凋亡。腫瘤中常存在SOCS基因的甲基化異常導致的失活,從而導致JAK2-STAT等信號通路持續(xù)異�；罨�。本研究的目的在于探討SOCS1和SOCS3對EML4-ALK融合基因陽性肺癌細胞的影響及其SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的甲基化情況。方法:甲基化特異性PCR檢測EML4-ALK陽性H2228肺癌細胞及肺癌組織中SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),并通過測序進行驗證。DNA甲基轉移酶抑制劑5’-Aza-d C處理H2228細胞,并通過real-time PCR和Western blot檢測SOCS1和SOCS3的表達水平變化。ALK抑制劑TAE684、ALK-Si RNA處理H2228細胞,抑制ALK表達,Western blot檢測p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6、SOCS1和SOCS3的表達水平變化。在EML4-ALK陰性表達的HEK293細胞中過表達ALK后,Western blot檢測JAK-STAT信號通路的活化情況及SOCS1和SOCS3的表達水平變化。用p EGFp-SOCS1和p EGFp-SOCS3質粒轉染H2228細胞,通過RT-PCR和Western blot檢測SOCS1和SOCS3的表達水平變化,檢驗轉染效果,并用EDU、CCK8和流式細胞計數(shù)檢測細胞的增殖能力和細胞周期的變化情況。結果:對7例EML4-ALK陽性肺癌患者腫瘤組織和EML4-ALK陽性細胞H2228進行甲基化特異性PCR反應,結果表明H2228細胞和所有的7例EML4-ALK陽性肺癌組織中都存在SOCS1啟動子區(qū)的部分甲基化,H2228細胞和7例組織中的3例存在SOCS3基因啟動子區(qū)的部分甲基化。Real-time RCR和Western-Blot結果也證明DNA甲基轉移酶抑制劑5'-Aza-d C去甲基化處理H2228細胞后SOCS1和SOCS3表達上調。HEK-293細胞過表達ALK 48h后,JAK-STAT信號通路被激活,ALK和p-ALK蛋白水平的表達明顯增高,伴隨著ALK和p-ALK的表達增強p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達也隨之增加。分別用ALK-Si-RNA和ALK抑制劑TAE-684處理H2228細胞后,ALK和p-ALK蛋白水平的表達明顯降低,并且p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達也都降低,JAK-STAT信號通路受到抑制。對H2228細胞進行p EGFp-SOCS1、p EGFp-SOCS3轉染處理后,H2228細胞中SOCS1和SOCS3的表達在轉錄水平上較對照組相比分別增高了10.3倍和93.4倍。Western-Blot結果示轉染SOCS1的H2228細胞中SOCS1的表達明顯增高,而轉染SOCS3的H2228細胞SOCS3表達也明顯增高,亦表明轉染是成功的。隨著SOCS1和SOCS3的表達明顯增加,我們發(fā)現(xiàn)兩組細胞中p-ALK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達均有所降低,說明JAK-STAT信號通路受到抑制。EDU的實驗結果表明H2228細胞在轉染SOCS1和SOCS3后,其細胞增殖能力都要明顯低于轉染空載體的H2228細胞。統(tǒng)計學結果顯示對照組細胞活力56.25%,p EGFp-SOCS1組細胞活力36.45%(P0.05),p EGFp-SOCS3組細胞活力38.72%(P0.05)。CCK-8結果與EDU結果一致,H2228細胞過表達SOCS1和SOCS3后與對照組相比,細胞代謝活性抑制率分別為48.49%(P0.05)和58.33%(P0.05)。FCM進行細胞周期分析,對照組與實驗組G1期和S期細胞數(shù)量基本沒有差異,但是兩個實驗組G2期細胞的數(shù)量均明顯高于對照組,統(tǒng)計學結果顯示兩個實驗組P值均小于0.05。結論:EML4-ALK(+)的H2228細胞及部分肺癌組織中存在SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的異常甲基化;HEK293細胞中過表達ALK后,JAK-STAT通路被激活,抑制H2228細胞中ALK表達后JAK-STAT通路被抑制,證明JAK-STAT通路可能是ALK的下游信號通路。H2228細胞中過表達SOCS1和SOCS3后,JAK-STAT通路被抑制,細胞的代謝活力和增殖能力受到抑制,流式細胞周期分析示兩個實驗組G2期細胞的數(shù)量均明顯高于對照組。我們斷定SOCS1和SOCS3主要是通過抑制JAK-STAT信號通路來抑制細胞代謝和增殖的,其對細胞周期的影響主要是對G2期/M期的阻滯。H2228細胞中SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的異常甲基化使得SOCS1和SOCS3的表達降低,其對JAK-STAT信號通路的抑制作用消失,最終導致腫瘤細胞的無限增殖。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：2402465