發(fā)布時間：2019-01-06 06:29

【摘要】：背景和目的:人類棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4和人類間變性淋巴瘤激酶融合基因EML4-ALK是新發(fā)現(xiàn)的非小細(xì)胞肺癌的驅(qū)動基因,具有獨特的臨床病理生理特征。ALK基因下游信號通路的異常持續(xù)激活是其重要的下游信號通路,而導(dǎo)致其下游基因持續(xù)激活的原因不明。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)是一類在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用的負(fù)調(diào)控因子,主要通過抑制JAK蛋白酪氨酸激酶(janus protein tyrosine kinase,JAK激酶)信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)即JAK-STAT等信號通路來調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。腫瘤中常存在SOCS基因的甲基化異常導(dǎo)致的失活,從而導(dǎo)致JAK2-STAT等信號通路持續(xù)異�；罨１狙芯康哪康脑谟谔接慡OCS1和SOCS3對EML4-ALK融合基因陽性肺癌細(xì)胞的影響及其SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的甲基化情況。方法:甲基化特異性PCR檢測EML4-ALK陽性H2228肺癌細(xì)胞及肺癌組織中SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),并通過測序進(jìn)行驗證。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5’-Aza-d C處理H2228細(xì)胞,并通過real-time PCR和Western blot檢測SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化。ALK抑制劑TAE684、ALK-Si RNA處理H2228細(xì)胞,抑制ALK表達(dá),Western blot檢測p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6、SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化。在EML4-ALK陰性表達(dá)的HEK293細(xì)胞中過表達(dá)ALK后,Western blot檢測JAK-STAT信號通路的活化情況及SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化。用p EGFp-SOCS1和p EGFp-SOCS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H2228細(xì)胞,通過RT-PCR和Western blot檢測SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化,檢驗轉(zhuǎn)染效果,并用EDU、CCK8和流式細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期的變化情況。結(jié)果:對7例EML4-ALK陽性肺癌患者腫瘤組織和EML4-ALK陽性細(xì)胞H2228進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng),結(jié)果表明H2228細(xì)胞和所有的7例EML4-ALK陽性肺癌組織中都存在SOCS1啟動子區(qū)的部分甲基化,H2228細(xì)胞和7例組織中的3例存在SOCS3基因啟動子區(qū)的部分甲基化。Real-time RCR和Western-Blot結(jié)果也證明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5'-Aza-d C去甲基化處理H2228細(xì)胞后SOCS1和SOCS3表達(dá)上調(diào)。HEK-293細(xì)胞過表達(dá)ALK 48h后,JAK-STAT信號通路被激活,ALK和p-ALK蛋白水平的表達(dá)明顯增高,伴隨著ALK和p-ALK的表達(dá)增強(qiáng)p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達(dá)也隨之增加。分別用ALK-Si-RNA和ALK抑制劑TAE-684處理H2228細(xì)胞后,ALK和p-ALK蛋白水平的表達(dá)明顯降低,并且p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達(dá)也都降低,JAK-STAT信號通路受到抑制。對H2228細(xì)胞進(jìn)行p EGFp-SOCS1、p EGFp-SOCS3轉(zhuǎn)染處理后,H2228細(xì)胞中SOCS1和SOCS3的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上較對照組相比分別增高了10.3倍和93.4倍。Western-Blot結(jié)果示轉(zhuǎn)染SOCS1的H2228細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)明顯增高,而轉(zhuǎn)染SOCS3的H2228細(xì)胞SOCS3表達(dá)也明顯增高,亦表明轉(zhuǎn)染是成功的。隨著SOCS1和SOCS3的表達(dá)明顯增加,我們發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞中p-ALK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達(dá)均有所降低,說明JAK-STAT信號通路受到抑制。EDU的實驗結(jié)果表明H2228細(xì)胞在轉(zhuǎn)染SOCS1和SOCS3后,其細(xì)胞增殖能力都要明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的H2228細(xì)胞。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示對照組細(xì)胞活力56.25%,p EGFp-SOCS1組細(xì)胞活力36.45%(P0.05),p EGFp-SOCS3組細(xì)胞活力38.72%(P0.05)。CCK-8結(jié)果與EDU結(jié)果一致,H2228細(xì)胞過表達(dá)SOCS1和SOCS3后與對照組相比,細(xì)胞代謝活性抑制率分別為48.49%(P0.05)和58.33%(P0.05)。FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析,對照組與實驗組G1期和S期細(xì)胞數(shù)量基本沒有差異,但是兩個實驗組G2期細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于對照組,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示兩個實驗組P值均小于0.05。結(jié)論:EML4-ALK(+)的H2228細(xì)胞及部分肺癌組織中存在SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的異常甲基化;HEK293細(xì)胞中過表達(dá)ALK后,JAK-STAT通路被激活,抑制H2228細(xì)胞中ALK表達(dá)后JAK-STAT通路被抑制,證明JAK-STAT通路可能是ALK的下游信號通路。H2228細(xì)胞中過表達(dá)SOCS1和SOCS3后,JAK-STAT通路被抑制,細(xì)胞的代謝活力和增殖能力受到抑制,流式細(xì)胞周期分析示兩個實驗組G2期細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于對照組。我們斷定SOCS1和SOCS3主要是通過抑制JAK-STAT信號通路來抑制細(xì)胞代謝和增殖的,其對細(xì)胞周期的影響主要是對G2期/M期的阻滯。H2228細(xì)胞中SOCS1和SOCS3啟動子區(qū)的異常甲基化使得SOCS1和SOCS3的表達(dá)降低,其對JAK-STAT信號通路的抑制作用消失,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增殖。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2402465