【摘要】：目的構(gòu)建和鑒定人骨誘導(dǎo)因子基因(hOGN)和綠色熒光蛋白(GFP)共表達(dá)慢病毒載體,并檢測(cè)其在人大腸癌細(xì)胞株HT-29中的表達(dá)水平。方法采用PCR方法克隆hOGN基因;將hOGN基因連接到帶有GFP的慢病毒表達(dá)載體pEZ-Lv201中構(gòu)建慢病毒載體;將構(gòu)建的慢病毒載體質(zhì)粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)與慢病毒包裝質(zhì)�；旌衔風(fēng)enti-PacHIVmix共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集慢病毒懸液;重組病毒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞,定量PCR法檢測(cè)重組病毒滴度;將構(gòu)建的pEZ-hOGN感染HT-29細(xì)胞,熒光顯微鏡觀(guān)察和Western印跡檢測(cè)感染后HT-29細(xì)胞中GFP表達(dá)情況和目的基因hOGN的表達(dá)情況。結(jié)果基因測(cè)序分析證實(shí)克隆的hOGN基因與GenBank提供的序列完全一致;構(gòu)建的重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實(shí)OGN正確插入pEZ-Lv201;定量PCR測(cè)定慢病毒滴度為0.1×10~9~1×10~9TU/ml。在HT-29細(xì)胞中重組病毒感染96h后在熒光顯微鏡下可檢測(cè)到較強(qiáng)的綠色熒光蛋白表達(dá),Western印跡檢測(cè)到在HT-29細(xì)胞中hOGN蛋白過(guò)表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶hOGN基因的重組慢病毒載體,在HT-29細(xì)胞中有效表達(dá)。
[Abstract]:Objective to construct and identify human bone inducible factor (hOGN) gene and green fluorescent protein (GFP) (GFP) co-expressing lentivirus vector and to detect its expression level in human colorectal cancer cell line HT-29. Methods the hOGN gene was cloned by PCR and the hOGN gene was ligated into the lentivirus expression vector pEZ-Lv201 with GFP to construct the lentivirus vector. The constructed lentivirus vector pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro (pEZ-hOGN) and lentivirus packaging plasmid Lenti-PacHIVmix were co-transfected into 293T cells to collect lentivirus suspensions. The recombinant virus was transfected into H1299 cells and the titer of the recombinant virus was detected by quantitative PCR. The expression of GFP and the expression of target gene hOGN were detected by fluorescence microscopy and Western blotting in the HT-29 cells infected with the constructed pEZ-hOGN. Results Gene sequencing confirmed that the cloned hOGN gene was exactly the same as that provided by GenBank, and the recombinant lentivirus vector was digested by double enzyme. Agarose gel electrophoresis confirmed that OGN was inserted into pEZ-Lv201; correctly. The titer of lentivirus detected by PCR was 0.1 脳 10 ~ (9) TU / ml ~ (-1) 脳 10 ~ (10) TU 路ml ~ (-1). Strong green fluorescent protein expression was detected under fluorescence microscope and overexpression of hOGN protein in HT-29 cells was detected by Western blot after 96 h infection of recombinant virus in HT-29 cells. Conclusion Recombinant lentivirus vector carrying hOGN gene was successfully constructed and effectively expressed in HT-29 cells.
【作者單位】： 四川大學(xué)生命科學(xué)院;成都市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科;成都市第三人民醫(yī)院普外科;成都市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究部;
【基金】：四川省科技廳資助項(xiàng)目(No.14ZC1219) 成都市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(No.2013089) 成都市科技廳資助項(xiàng)目(No.2014-HM01-00217-SF)
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

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9 張U，

本文編號(hào)：2402322