【摘要】：目的構(gòu)建和鑒定人骨誘導因子基因(hOGN)和綠色熒光蛋白(GFP)共表達慢病毒載體,并檢測其在人大腸癌細胞株HT-29中的表達水平。方法采用PCR方法克隆hOGN基因;將hOGN基因連接到帶有GFP的慢病毒表達載體pEZ-Lv201中構(gòu)建慢病毒載體;將構(gòu)建的慢病毒載體質(zhì)粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)與慢病毒包裝質(zhì)�；旌衔風enti-PacHIVmix共轉(zhuǎn)染293T細胞,收集慢病毒懸液;重組病毒轉(zhuǎn)染H1299細胞,定量PCR法檢測重組病毒滴度;將構(gòu)建的pEZ-hOGN感染HT-29細胞,熒光顯微鏡觀察和Western印跡檢測感染后HT-29細胞中GFP表達情況和目的基因hOGN的表達情況。結(jié)果基因測序分析證實克隆的hOGN基因與GenBank提供的序列完全一致;構(gòu)建的重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實OGN正確插入pEZ-Lv201;定量PCR測定慢病毒滴度為0.1×10~9~1×10~9TU/ml。在HT-29細胞中重組病毒感染96h后在熒光顯微鏡下可檢測到較強的綠色熒光蛋白表達,Western印跡檢測到在HT-29細胞中hOGN蛋白過表達。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶hOGN基因的重組慢病毒載體,在HT-29細胞中有效表達。
[Abstract]:Objective to construct and identify human bone inducible factor (hOGN) gene and green fluorescent protein (GFP) (GFP) co-expressing lentivirus vector and to detect its expression level in human colorectal cancer cell line HT-29. Methods the hOGN gene was cloned by PCR and the hOGN gene was ligated into the lentivirus expression vector pEZ-Lv201 with GFP to construct the lentivirus vector. The constructed lentivirus vector pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro (pEZ-hOGN) and lentivirus packaging plasmid Lenti-PacHIVmix were co-transfected into 293T cells to collect lentivirus suspensions. The recombinant virus was transfected into H1299 cells and the titer of the recombinant virus was detected by quantitative PCR. The expression of GFP and the expression of target gene hOGN were detected by fluorescence microscopy and Western blotting in the HT-29 cells infected with the constructed pEZ-hOGN. Results Gene sequencing confirmed that the cloned hOGN gene was exactly the same as that provided by GenBank, and the recombinant lentivirus vector was digested by double enzyme. Agarose gel electrophoresis confirmed that OGN was inserted into pEZ-Lv201; correctly. The titer of lentivirus detected by PCR was 0.1 脳 10 ~ (9) TU / ml ~ (-1) 脳 10 ~ (10) TU 路ml ~ (-1). Strong green fluorescent protein expression was detected under fluorescence microscope and overexpression of hOGN protein in HT-29 cells was detected by Western blot after 96 h infection of recombinant virus in HT-29 cells. Conclusion Recombinant lentivirus vector carrying hOGN gene was successfully constructed and effectively expressed in HT-29 cells.
【作者單位】： 四川大學生命科學院;成都市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科;成都市第三人民醫(yī)院普外科;成都市第三人民醫(yī)院實驗醫(yī)學研究部;
【基金】：四川省科技廳資助項目(No.14ZC1219) 成都市衛(wèi)生局資助項目(No.2013089) 成都市科技廳資助項目(No.2014-HM01-00217-SF)
【分類號】：R735.34

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李振宇;慢病毒載體構(gòu)建及結(jié)構(gòu)優(yōu)化[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);2002年05期

2 主鴻鵠;慢病毒載體及其對低分裂潛能細胞的基因轉(zhuǎn)移[J];白血病.淋巴瘤;2003年01期

3 楊宇娟,裴冬生,徐開林,潘秀英,何徐彭,張成靜;survivin反義RNA的克隆及慢病毒載體的構(gòu)建[J];徐州醫(yī)學院學報;2005年06期

4 焦伊勝;王永來;張淑蘭;王桂玲;;凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2008年24期

5 褚波;黃雪峰;唐云明;;慢病毒載體及其應用進展[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2008年01期

6 毛穎佳;鄭源強;石艷春;;慢病毒載體及其應用的研究進展[J];中國生物制品學雜志;2009年02期

7 曾錦芳;王少元;;慢病毒載體及其在血液病研究中的應用進展[J];醫(yī)學綜述;2011年08期

8 馬強;舒文;李明;吳英松;;一種新型慢病毒載體制備體系的改進[J];熱帶醫(yī)學雜志;2011年08期

9 張薇;趙志英;張坤;;慢病毒載體及應用研究進展[J];包頭醫(yī)學院學報;2011年05期

10 何佳平;方_g聃;張帆;孫鳳強;王娟;張敬之;;慢病毒載體轉(zhuǎn)錄通讀率檢測方法的建立[J];生物工程學報;2013年07期

相關(guān)會議論文 前10條

1 馮東福;畢永延;陳二濤;王永志;楚勝華;;小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒載體的構(gòu)建及神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)染[A];中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學分會第九次學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

2 李振宇;徐開林;潘秀英;陳香梅;鹿群先;主鴻鵠;李慧;陳海英;何徐彭;;慢病毒載體的構(gòu)建及其包裝細胞系的建立[A];中華醫(yī)學會第八次全國血液學學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

3 王海彬;;雌激素相關(guān)受體α基因超表達慢病毒載體的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學會第六次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學術(shù)會議暨中華醫(yī)學會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會成立十周年論文匯編[C];2011年

4 張曉宇;秦宜德;王超;張文曉;王巍;何曉光;;牛乳鐵蛋白肽基因的慢病毒載體構(gòu)建[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2010年學術(shù)交流會論文集[C];2010年

5 李振宇;徐開林;潘秀英;鹿群先;;慢病毒載體的構(gòu)建、改造及其包裝細胞系的建立[A];2005年華東六省一市血液病學學術(shù)會議暨浙江省血液病學學術(shù)年會論文匯編[C];2005年

6 王玉蘭;任振華;;感染食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞的病毒載體研究[A];第十三次全國臨床藥理學學術(shù)大會論文匯編[C];2012年

7 黃新鳳;葉金波;蔣英芝;任曉虎;黃培武;劉建軍;;SET shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其在肝細胞中的表達鑒定[A];中國科協(xié)第十四屆年會第十七分會場環(huán)境危害與健康防護研討會論文集[C];2012年

8 楊龍江;侯健;;構(gòu)建含有人血小板因子4和其片段的慢病毒載體[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

9 李振宇;徐開林;潘秀英;鹿群先;孫海英;主鴻鵠;陳香梅;何徐彭;;慢病毒載體的構(gòu)建、改造及其包裝細胞系的建立[A];第九屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2003年

10 劉峰;肖興鵬;田玉科;;大鼠蛋白激酶Cγ可控shRNA慢病毒的構(gòu)建與鑒定[A];2011年全國醫(yī)藥學術(shù)論壇交流會暨臨床藥學與藥學服務研究進展培訓班論文集[C];2011年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 原莉莉;慢病毒載體介導的HSP47 siRNA抑制PVR的研究[D];天津醫(yī)科大學;2015年

2 張志強;輻射誘導型SOD2過表達慢病毒載體的構(gòu)建及其在結(jié)腸癌放療中的輻射防護和放療增敏效應[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

3 楊玉芳;用LMP1構(gòu)建重組慢病毒載體及建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型[D];第一軍醫(yī)大學;2004年

4 徐世永;慢病毒載體法高效轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2007年

5 王玉梅;人PTEN基因RNAi和RESC慢病毒載體的構(gòu)建及其功能的相關(guān)性研究[D];鄭州大學;2011年

6 吳福國;表達Cdc42-shRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建及其對膀胱癌細胞影響的實驗研究[D];蘭州大學;2007年

7 馬強;腫瘤翻譯調(diào)控蛋白（TCTP）對結(jié)腸癌細胞LoVo的生物學特性影響及安全型慢病毒載體構(gòu)建探索[D];南方醫(yī)科大學;2009年

8 郝又國;攜帶Rab9 cDNA的慢病毒對C型Niemann-Pick病小鼠的神經(jīng)保護作用[D];華中科技大學;2009年

9 楊歡;慢病毒介導中國人產(chǎn)甲酸草酸桿菌中草酸分解基因FRC和OXC轉(zhuǎn)染肝干細胞的實驗研究[D];華中科技大學;2011年

10 張文卿;HCMV pp150表達及E1-pp65慢病毒載體刺激T細胞免疫應答的研究[D];山東大學;2006年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 熊冬蘭;白細胞介素-18基因慢病毒表達載體抗肺癌作用的研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

2 許媛;TWEAK慢病毒載體的構(gòu)建及在肝癌細胞中的表達與功能初步研究[D];川北醫(yī)學院;2015年

3 鄧乃剛;p.93K-T QDPR基因慢病毒過表達載體的構(gòu)建[D];河北聯(lián)合大學;2014年

4 徐小隔;Let-7d慢病毒載體對體外骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化的影響[D];鄭州大學;2015年

5 王碩;慢病毒介導BMPR Ⅱ基因沉默對人肝癌移植瘤生長的影響[D];南昌大學醫(yī)學院;2015年

6 操儲云;4個沉默雞Ii基因慢病毒載體的構(gòu)建及其效果比較[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2014年

7 楊碧慧;RNA干擾靶向沉默SPAG6基因?qū)θ薓DS細胞體內(nèi)外生長的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

8 王旋;SIRT2調(diào)節(jié)HSP90活性的分子機制[D];河南大學;2015年

9 張U，

本文編號：2402322