發(fā)布時(shí)間：2018-12-25 20:09

【摘要】：羅非魚是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類,但近年來由于羅非魚病害的大規(guī)模爆發(fā),給羅非魚產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重威脅。鏈球菌是目前全球公認(rèn)的感染羅非魚最重要的病原體,尚未發(fā)現(xiàn)有效的防治措施。開展羅非魚免疫相關(guān)基因的挖掘及其功能分析研究工作,解析羅非魚的免疫調(diào)控機(jī)制,為下一步進(jìn)行抗病相關(guān)標(biāo)記的篩選,輔助抗病羅非魚品種的選育奠定基礎(chǔ),對(duì)于羅非魚鏈球菌病的防治工作具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)對(duì)病原體的識(shí)別,是啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵一步。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體,也被認(rèn)為是機(jī)體抵抗病原微生物感染的關(guān)鍵受體。本實(shí)驗(yàn)克隆得到尼羅羅非魚TLRs(TLR2、TLR3、TLR5、TLR13、TLR21、TLR22和TLR23)的c DNA序列全長(zhǎng),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其在各組織和器官及胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)量以及感染鏈球菌后表達(dá)的變化;構(gòu)建各基因真核表達(dá)載體,并研究魚體中過表達(dá)TLRs對(duì)TLR信號(hào)通路下游基因表達(dá)的影響,以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)TLRs基因后,對(duì)NF-κB活性的影響;用克隆測(cè)序的方法分析TLR22和TLR23基因多態(tài)性以及該基因多態(tài)性與羅非魚鏈球菌病抗性的關(guān)系,為羅非魚抗病品系選育提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.尼羅羅非魚TLRs基因cDNA的克隆與相關(guān)生物信息學(xué)分析采用同源克隆和c DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)得到TLRs的c DNA序列,并用特異引物直接擴(kuò)增法獲得部分TLRs(TLR3、TLR21、TLR22和TLR23)基因組序列。尼羅羅非魚TLR2(On TLR2)c DNA序列全長(zhǎng)3677bp,其開放閱讀框序列(ORF)為2670 bp,編碼889個(gè)氨基酸殘基;On TLR3基因全長(zhǎng)為5662bp,包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,其ORF為2739 bp,編碼912個(gè)氨基酸殘基;On TLR5基因c DNA序列全長(zhǎng)3500bp,ORF為2664 bp,編碼887個(gè)氨基酸殘基;On TLR13基因c DNA序列全長(zhǎng)3905bp,ORF為2835 bp,編碼944個(gè)氨基酸殘基;On TLR21基因c DNA序列全長(zhǎng)3196bp(Gen Bank No.KJ010824),ORF為2940bp,編碼979個(gè)氨基酸殘基;On TLR22基因序列全長(zhǎng)3440bp(Gen Bank No.KJ010825),包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,ORF長(zhǎng)2808bp,編碼935個(gè)氨基酸殘基;On TLR23基因序列全長(zhǎng)3789bp,包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,ORF長(zhǎng)2817bp,編碼938個(gè)氨基酸殘基。2.尼羅羅非魚TLRs基因的組織表達(dá)分析利用所得尼羅羅非魚TLRs基因c DNA序列,設(shè)計(jì)特異性引物,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)TLRs基因m RNA在各組織或器官中的表達(dá)量;并分析其在羅非魚胚胎發(fā)育過程中表達(dá)量的變化情況,以及用羅非魚源無乳鏈球菌(Streptococcus agalatiae)感染后,分析TLRs基因在各組織或器官中表達(dá)量的變化。定量PCR分析結(jié)果顯示,TLRs在健康尼羅羅非魚腎、腦、心臟、脾臟、鰓、肝臟、胃、肌肉、腸、血液和皮膚中均有表達(dá),但不同TLRs在不同組織或器官的表達(dá)量有所差異。On TLR2在腦和胃中表達(dá)量最高,在肝臟中表達(dá)量最低;On TLR3在脾臟中表達(dá)量最高,在肝臟中表達(dá)量最低;On TLR5在血液中表達(dá)量最高,在腎臟中表達(dá)量最低;On TLR13在脾臟中表達(dá)量最高,在肝臟中表達(dá)量最低;On TLR21在鰓中的表達(dá)量最高,在肝臟中表達(dá)量最低;On TLR22在脾臟中表達(dá)量最高,在肝臟中表達(dá)量最低;On TLR23在血液中表達(dá)量最高,在胃中表達(dá)量最低。實(shí)時(shí)定量PCR分析TLRs基因在尼羅羅非魚胚胎發(fā)育過程中(2.5 d、3.5 d、4.5 d、5 d、5.5 d、6 d、6.5 d、7.5 d和8.5 d)表達(dá)量變化,結(jié)果顯示,胚胎發(fā)育過程中所檢測(cè)的TLRs均有表達(dá),不同的TLRs在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)變化情況不同,但均有上升趨勢(shì),且均在5d-6.5d達(dá)到峰值。無乳鏈球菌感染后,TLR2、TLR3、TLR5、TLR13和TLR21在所檢測(cè)組織的表達(dá)量多數(shù)有明顯的上調(diào),而TLR22和TLR23在所檢測(cè)組織的表達(dá)量均呈下調(diào)。3.羅非魚魚體內(nèi)過表達(dá)TLRs基因后,對(duì)尼羅羅非魚TLR信號(hào)通路相關(guān)下游基因表達(dá)影響本研究將pc DNA3.1/CT-GFP-TOPO?和構(gòu)建的TLRs基因ORF真核表達(dá)載體肌肉注射健康羅非魚體內(nèi),用PGN(20μg/尾)刺激目的基因過表達(dá)后,腹腔注射無乳鏈球菌(100μl),檢測(cè)TLRs信號(hào)通路下游基因的表達(dá)譜。結(jié)果顯示,On TLRs過表達(dá)后可使Myd88在腸和肝臟中的表達(dá)量大多數(shù)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),而在腦中的表達(dá)量大多數(shù)呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì),On TLRs和On Myd88過表達(dá)后,TRAF3在腸中的表達(dá)量均顯著上調(diào),同樣,TRAF6和TRF3在腸中的表達(dá)量多數(shù)呈現(xiàn)上調(diào)作用。4.哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中過表達(dá)尼羅羅非魚TLRs基因?qū)F-κB活性的影響本研究為確定尼羅羅非魚TLR2、TLR21、TLR22和TLR23對(duì)NF-κB活性的影響,分別成功構(gòu)建了pc DNA3.1-TLR2、pc DNA3.1-TLR21、pc DNA3.1-TLR22、pc DNA3.1-TLR23和pc DNA3.1-Myd88真核表達(dá)載體。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示:單一的pc DNA3.1-TLR2、pc DNA3.1-TLR21、pc DNA3.1-TLR22和 pc DNA3.1-TLRs與pc DNA3.1-Myd88真核表達(dá)載體共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞時(shí),可顯著增強(qiáng)NF-κB活性。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)On TLR2、On TLR21、On TLR22和On TLR23均定位于細(xì)胞膜上。pc DNA3.1-TLR23過表達(dá)于293 T細(xì)胞并不能使NF-κB活性增強(qiáng),但5.TLRs基因與羅非魚鏈球菌抗性的關(guān)系為了解TLR22和TLR23基因多態(tài)性與尼羅羅非魚鏈球菌病抗性的相關(guān)關(guān)系,本研究用設(shè)計(jì)特異性引物,分別從尼羅羅非魚20個(gè)家系的20尾感病個(gè)體和20尾抗病個(gè)體的基因組DNA中擴(kuò)增TLR22和TLR23基因片段,在TLR22中發(fā)現(xiàn)25個(gè)SNP位點(diǎn)和9個(gè)增添/缺失部位/位點(diǎn),經(jīng)分析初步確定與無乳鏈球菌抗性相關(guān)的16個(gè)SNP位點(diǎn)和3個(gè)增添/缺失部位。TLR23中發(fā)現(xiàn)20個(gè)突變位點(diǎn),其中14個(gè)位點(diǎn)在編碼區(qū),6個(gè)位點(diǎn)在非編碼區(qū)。兩者尚未發(fā)現(xiàn)抗病相關(guān)的基因型。這些變異性位點(diǎn)的獲得僅是在人工感染的感病和抗病群體中獲得,我們擬在構(gòu)建的家系中進(jìn)行驗(yàn)證,以進(jìn)一步分析其應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果為抗病尼羅羅非魚選育奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2391579