【摘要】：甲狀腺腫瘤是一種常見的頸部腫瘤,其發(fā)病率女性明顯高于男性,因而很多學(xué)者認(rèn)為這種差異性很可能與男女體內(nèi)性激素水平有關(guān)。孕激素是一種雌性激素,主要在生殖、發(fā)育系統(tǒng)上發(fā)揮作用。但是隨著孕激素類藥物被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)等上,給社會帶來巨大貢獻(xiàn)的同時,也給環(huán)境帶來了嚴(yán)重的激素污染,已經(jīng)開始影響到生物體自身的內(nèi)分泌系統(tǒng)。孕激素受體(Progesterone receptor,PR)屬于核受體,只有當(dāng)PR被孕激素激活后才能結(jié)合到孕激素受體應(yīng)答元件的DNA區(qū)域,從而啟動受體應(yīng)答元件下游靶基因的表達(dá)。本課題利用這種機(jī)制并將螢光素酶報(bào)告基因克隆到受體應(yīng)答元件下游,從而建立了一種高靈敏度、高通量的可用于孕激素水平生物檢測的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,并將其應(yīng)用于甲狀腺相關(guān)腫瘤病人血液中的孕激素類物質(zhì)水平的檢測分析,以期探究孕激素類物質(zhì)與甲狀腺腫瘤發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。本研究共構(gòu)建了含有孕激素受體基因的3種不同表達(dá)載體和3種含有不同串聯(lián)倍數(shù)的孕激素受體應(yīng)答元件片段的載體,通過螢光素酶的活性分析,利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)將活性最高的一對重組質(zhì)粒pEGFP-N2-hPR/pGL4-PRE4轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,然后經(jīng)過抗生素篩選和有限稀釋法挑選出10個單克隆細(xì)胞株。再利用分子克隆技術(shù)、亞細(xì)胞定位技術(shù)鑒定出陽性單克隆細(xì)胞株。從第5代到第23代細(xì)胞的螢光素酶活性的檢測結(jié)果表明該細(xì)胞株具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性和較高的靈敏度,其檢出限可以達(dá)到10 pM。因此,該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株與螢光素酶活性檢測技術(shù)結(jié)合起來即建立孕激素檢測分析系統(tǒng)。同時,還觀察到細(xì)胞株的螢光素酶活性隨著外界環(huán)境中孕激素濃度的升高而增強(qiáng),但是濃度高于106 pM孕激素反而會降低螢光素酶活性甚至是引起細(xì)胞死亡,這也可以說明環(huán)境中孕激素長期污染能給動物和人類健康造成危害,人類應(yīng)該更加高度重視環(huán)境激素污染問題。為了研究孕激素水平和女性甲狀腺腫瘤高發(fā)率之間的關(guān)聯(lián)性,本研究利用孕激素受體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株檢測分析系統(tǒng)對甲狀腺相關(guān)腫瘤疾病的女性患者血清中孕激素水平進(jìn)行檢測分析。經(jīng)過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),甲狀腺癌病人的血清中孕激素水平低于與正常人血清中孕激素水平,并且有26.7%甲狀腺腫瘤病人血清種孕激素平均水平低于1 nM,而正常組血清孕激素平均水平都高于1 nM;正常組中有22.7%樣品的孕激素水平超過50 nM,而甲狀腺腫瘤組中卻沒有。通過差異性分析顯示甲狀腺腫瘤組和正常組的孕激素水平存在顯著性差異。盡管女性體內(nèi)孕激素水平的波動較大,但本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫瘤患者血液中的孕激素水平明顯低于正常人血液中孕激素水平,提示在一定范圍內(nèi)甲狀腺腫瘤患者腫瘤的發(fā)生與體內(nèi)孕激素水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),故深入研究女性血液中孕激素水平可能對于甲狀腺腫瘤早期診斷具有一定的參考價(jià)值。
[Abstract]:Thyroid neoplasms are a common cervical tumor. The incidence of thyroid neoplasms is significantly higher in women than in men, so many scholars believe that this difference may be related to sex hormone levels in men and women. Progesterone is an estrogen that plays a major role in the reproductive and developmental system. However, progesterone drugs have been widely used in medical treatment, animal husbandry and agriculture, which have brought great contributions to the society, but also brought serious hormone pollution to the environment, which has begun to affect the endocrine system of the organism itself. Progesterone receptor (Progesterone receptor,PR) is a nuclear receptor. Only when PR is activated by progesterone can it bind to the DNA region of the progesterone receptor response element, thus initiating the expression of downstream target gene of the receptor response element. By using this mechanism and cloning the luciferase reporter gene downstream into the receptor response element, a highly sensitive and high-throughput stable cell line was established for bioassay at progesterone level. It was applied to detect and analyze the levels of progesterone in the blood of patients with thyroid associated neoplasms in order to explore the relationship between progesterone and thyroid tumorigenesis. In this study, three different expression vectors containing progesterone receptor gene and three vectors containing different tandem multiple progesterone receptor response element fragments were constructed, and the activity of luciferase was analyzed. A pair of recombinant plasmids pEGFP-N2-hPR/pGL4-PRE4 with the highest activity were transfected into HeLa cells by co-transfection technique, and then 10 monoclonal cell lines were selected by antibiotic screening and limited dilution method. The positive monoclonal cell lines were identified by molecular cloning and subcellular localization. The results of luciferase activity from passage 5 to passage 23 showed that the cell line had strong genetic stability and high sensitivity, and the detection limit could reach 10 pM.. Therefore, the stably transformed cell line was combined with luciferase assay to establish a progesterone assay system. It was also observed that the activity of luciferase increased with the increase of progesterone concentration in the environment, but the concentration of progesterone above 106 pM decreased the activity of luciferase and even led to cell death. This can also show that long-term pollution of progesterone in the environment can cause harm to animal and human health, and human should pay more attention to the problem of environmental hormone pollution. To study the relationship between progesterone levels and the high incidence of thyroid neoplasms in women, In this study, the serum progesterone levels in female patients with thyroid associated tumor diseases were analyzed by using a stable cell line analysis system of progesterone receptor. Biostatistical analysis showed that the serum progesterone level in thyroid cancer patients was lower than that in normal controls, and the average serum progesterone level was less than 1 nM, in 26.7% of thyroid cancer patients. The average serum progesterone level in normal group was higher than 1 nM;. Progesterone levels exceeded 50 nM, in 22.7% of normal controls and not in thyroid neoplasms. Difference analysis showed that there were significant differences in progesterone levels between thyroid tumor group and normal group. Although the levels of progesterone fluctuate in women, this study found that the levels of progesterone in patients with thyroid tumors were significantly lower than those in normal people. The results suggest that there is a negative correlation between tumor occurrence and progesterone level in patients with thyroid neoplasms in a certain range, so it may be valuable to study the serum progesterone levels in women for early diagnosis of thyroid neoplasms.
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R736.1;R730.43

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本文編號：2374181