【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(簡(jiǎn)稱Bt)是一種非常重要的生防微生物,具備靶標(biāo)特異性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn),符合可持續(xù)發(fā)展的需求。但是Bt制劑也存在殺蟲效果較慢、毒力有限以及田間應(yīng)用不穩(wěn)定的缺點(diǎn),限制了Bt產(chǎn)品大規(guī)模推廣。提高殺蟲晶體蛋白含量或者提升芽胞形成率,從而達(dá)到提高產(chǎn)量的目的是提高其毒力行之有效的方法。本實(shí)驗(yàn)室前期在尋找母細(xì)胞裂解關(guān)鍵水解酶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有高轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示RS24960基因具有非常高的轉(zhuǎn)錄活性。利用β-半乳糖苷酶報(bào)告系統(tǒng)分析證實(shí)該啟動(dòng)子PRS24960是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子。在不同的sigma突變體中分析啟動(dòng)子的活性,發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子受σE特異性控制。通過5'-RACE實(shí)驗(yàn)鑒定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),表明轉(zhuǎn)錄起始是位于起始密碼TTG上游55bp的堿基A。鑒于PRS24960具有高轉(zhuǎn)錄活性,利用啟動(dòng)子PRS24960指導(dǎo)cry1Ac基因表達(dá),通過SDS-PAGE和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所得Bt菌株Cry1Ac蛋白積累量及特異性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子能與已報(bào)道的強(qiáng)cry類基因啟動(dòng)子Porf1cry8E以及cry1Ac基因本身啟動(dòng)子一樣,高效地指導(dǎo)Cry1Ac蛋白的表達(dá)和積累,三個(gè)菌株間沒有顯著差別。進(jìn)一步的殺蟲活性檢測(cè)表明,含不同啟動(dòng)子指導(dǎo)表達(dá)cry1Ac的菌株對(duì)二齡小菜蛾幼蟲具有相似水平的殺蟲活性。然而,透射電子顯微鏡(TEM)和原子力顯微鏡(AFM)觀察菌株和晶體形態(tài)發(fā)現(xiàn)PRS24960與Porf1cry8E指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白均不能組裝成完美的雙錐體晶體結(jié)構(gòu)。此外,對(duì)RS24960基因功能進(jìn)行研究。UniProt、STRING和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,RS24960編碼一個(gè)含HTH-DEOR保守結(jié)構(gòu)的小分子蛋白,但是其功能未知。利用同源重組方法在Bt HD73中敲除該基因獲得突變株HD△RS24960,生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)突變株生長(zhǎng)不受影響,而顯微鏡觀察顯示突變株芽胞形成和母細(xì)胞裂解時(shí)間提前,同時(shí)用FM4-64標(biāo)記活細(xì)胞膜,在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)HD△RS24960在芽胞形成早期就與野生型有區(qū)別。此外,芽胞形成率測(cè)定發(fā)現(xiàn)突變株HD△RS24960的芽胞形成率升高。這些表型得到了遺傳互補(bǔ)驗(yàn)證,從而證明RS24960在芽胞形成早期就已經(jīng)參與芽胞形成調(diào)控。在大腸桿菌中成功表達(dá)RS24960蛋白,以期尋找該蛋白的作用靶標(biāo),進(jìn)一步揭示其生物學(xué)功能。本文對(duì)RS24960基因功能及其啟動(dòng)子進(jìn)行了分析,為利用非cry基因啟動(dòng)子成功指導(dǎo)cry基因表達(dá)提供了一個(gè)成功的例子,同時(shí)為鑒定RS24960基因功能,揭示蘇云金芽胞桿菌芽胞形成調(diào)控機(jī)制提供了新的重要的依據(jù),為今后芽胞桿菌遺傳改良和應(yīng)用提供了新的遺傳資源和方法。
[Abstract]:Bacillus thuringiensis (Bt) is a very important biocontrol microorganism with high target specificity and environmental friendliness. However, Bt also has the disadvantages of slow insecticidal effect, limited virulence and unstable field application, which limits the large-scale popularization of Bt products. It is an effective method to improve the virulence of insecticidal crystal protein content or the formation rate of spores in order to increase the yield. A promoter with high transcriptional activity was found in our laboratory in search of the transcriptional regulation mechanism of the key hydrolase in mother cell lysis. Transcriptome data showed that the RS24960 gene had very high transcriptional activity. The 尾-galactosidase report system analysis confirmed that the promoter PRS24960 was a strong promoter. The promoter activity was analyzed in different sigma mutants and it was found that the promoter was controlled by 蟽 E specificity. The transcriptional initiation sites were identified by 5'-RACE experiments, indicating that transcriptional initiation is the base Abase of 55bp upstream of the initiation codon TTG. In view of the high transcriptional activity of PRS24960, the promoter PRS24960 was used to direct the expression of cry1Ac gene. The accumulation and specificity of Cry1Ac protein in Bt strain were detected by SDS-PAGE and Western blot experiments. The results showed that the promoter could effectively direct the expression and accumulation of Cry1Ac protein as well as the reported strong cry gene promoter Porf1cry8E and cry1Ac gene itself promoter. There was no significant difference among the three strains. Further detection of insecticidal activity showed that the strains expressing cry1Ac with different promoters had similar insecticidal activity against the second instar diamondback moth larvae. However, the transmission-electron microscopy (TEM) and atomic force microscopy (AFM) showed that the expression of Cry1Ac protein guided by PRS24960 and Porf1cry8E could not be assembled into a perfect double pyramidal crystal structure. In addition, the function of RS24960 gene was studied. UniProt,STRING and NCBI database analysis showed that RS24960 encodes a small protein containing conserved structure of HTH-DEOR, but its function is unknown. Homologous recombination method was used to detect the growth curve of mutant strain HD RS24960, by knockout of the gene in Bt HD73. The results showed that the growth of mutant strain was not affected, but the microscopical observation showed that the time of spores formation and mother cell cleavage of mutant strain was earlier. At the same time, the living cell membrane was labeled with FM4-64 and observed under confocal laser microscope. It was found that HD RS24960 was different from wild type in the early stage of spores formation. In addition, the spore formation rate of the mutant HD RS24960 was increased. These phenotypes were verified by genetic complementation, which showed that RS24960 had been involved in the regulation of spores formation in the early stage of spore formation. RS24960 protein was successfully expressed in Escherichia coli in order to find its target and further reveal its biological function. In this paper, the function of RS24960 gene and its promoter were analyzed, which provided a successful example for the successful use of non-cry gene promoter to guide the expression of cry gene, and to identify the function of RS24960 gene. Revealing the regulation mechanism of Bacillus thuringiensis spores provides a new important basis for the genetic improvement and application of Bacillus thuringiensis and provides a new genetic resource and method for the future application of Bacillus thuringiensis.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S476

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李建洪,萬秋英,王沫,姜錫權(quán),喻子牛;蘇云金芽胞桿菌新菌株的研究[J];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年05期

2 樂超銀,喻子牛;整合質(zhì)粒對(duì)蘇云金芽胞桿菌轉(zhuǎn)化的研究[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年04期

3 蔡啟良,劉子鐸,喻子牛;蘇云金芽胞桿菌生物活性成分研究進(jìn)展[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2003年02期

4 彭可凡;戴順英;陳訊;高梅影;;蘇云金芽胞桿菌的分離與鑒定及高毒力菌株的篩選[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2005年S2期

5 周學(xué)永;楊志生;金紅;吳新世;;蘇云金芽胞桿菌劑型研究進(jìn)展[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年01期

6 周學(xué)永;楊志生;金紅;吳新世;;蘇云金芽胞桿菌劑型研究進(jìn)展[J];農(nóng)藥市場(chǎng)信息;2006年07期

7 張東升;曹文偉;毛連菊;朱瑩;;利用魚粉生產(chǎn)中的廢水培養(yǎng)蘇云金芽胞桿菌的可行性研究[J];大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年06期

8 劉晶晶;束長(zhǎng)龍;張杰;宋福平;黃大f ;;蘇云金芽胞桿菌內(nèi)生質(zhì)粒提取方法的改進(jìn)[J];生物技術(shù)通報(bào);2008年06期

9 劉雅琪;李明順;喻子牛;;蘇云金芽胞桿菌受體菌株的篩選及電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化[J];才智;2008年19期

10 潘潔茹;關(guān)怡;鄭能雄;黃天培;關(guān)雄;;含鈾土壤中蘇云金芽胞桿菌的分離與鑒定[J];莆田學(xué)院學(xué)報(bào);2010年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 樂超銀;孫明;喻子牛;;蘇云金芽胞桿菌廣譜、遺傳穩(wěn)定工程菌的構(gòu)建[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國(guó)生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

2 喻子牛;孟盈;孫明;何進(jìn);李明順;鄭世學(xué);;蘇云金芽胞桿菌新基因資源的發(fā)掘策略[A];第三屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì)會(huì)議論文摘要集[C];2011年

3 趙昌明;劉曉艷;羅毅;宋春旭;阮麗芳;喻子牛;孫明;;蘇云金芽胞桿菌中兩種非蛋白質(zhì)殺蟲物質(zhì)的生物合成途徑[A];中國(guó)微生物學(xué)會(huì)《第二屆全國(guó)農(nóng)業(yè)微生物研究及產(chǎn)業(yè)化研討會(huì)》和《第十一屆全國(guó)殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)》暨《湖北省暨武漢市微生物學(xué)會(huì)和內(nèi)蒙古微生物學(xué)會(huì)2008年會(huì)》論文摘要[C];2008年

4 馮亮;陳守文;孫明;喻子牛;;透明顫菌血紅蛋白在蘇云金芽胞桿菌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和晶體合成的促進(jìn)作用[A];第十屆全國(guó)殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)暨全國(guó)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化會(huì)議論文摘要集[C];2006年

5 關(guān)雄;;蘇云金芽胞桿菌新資源及其生物活性因子研究[A];中國(guó)微生物學(xué)會(huì)《第二屆全國(guó)農(nóng)業(yè)微生物研究及產(chǎn)業(yè)化研討會(huì)》和《第十一屆全國(guó)殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)》暨《湖北省暨武漢市微生物學(xué)會(huì)和內(nèi)蒙古微生物學(xué)會(huì)2008年會(huì)》論文摘要[C];2008年

6 孫明;喻子牛;陳守文;劉子鐸;李林;;蘇云金芽胞桿菌基因工程菌的構(gòu)建和開發(fā)[A];第十屆全國(guó)殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)暨全國(guó)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化會(huì)議論文摘要集[C];2006年

7 鄭大勝;袁永明;謝作蓉;蔡全信;閆建平;袁志明;;表達(dá)蘇云金芽胞桿菌殺蚊毒素的離中不粘柄菌的部分特性研究[A];中國(guó)微生物學(xué)會(huì)《第二屆全國(guó)農(nóng)業(yè)微生物研究及產(chǎn)業(yè)化研討會(huì)》和《第十一屆全國(guó)殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)》暨《湖北省暨武漢市微生物學(xué)會(huì)和內(nèi)蒙古微生物學(xué)會(huì)2008年會(huì)》論文摘要[C];2008年

8 孫明;戴經(jīng)元;陳亞華;劉子鐸;羅曦霞;喻凌;喻子牛;;蘇云金芽胞桿菌不同類型晶體蛋白抗原的制備[A];殺蟲微生物[C];1992年

9 周鄒;郭剛;阮麗芳;喻子牛;孫明;;在許多蘇云金芽胞桿菌中S-層蛋白可形成伴胞晶體[A];“環(huán)境與健康”學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2007年

10 鄒雪;余子全;孫明;喻子牛;;利用染色方法篩選對(duì)根結(jié)線蟲高毒力的蘇云金芽胞桿菌[A];生命科學(xué)與微生物專輯[C];2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 徐承晨;蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)及功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 劉永磊;蘇云金芽胞桿菌對(duì)灰飛虱高效殺蟲新基因的挖掘與功能研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 羅曉霞;蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白Cry5Ba沉默機(jī)制的研究及殺線蟲毒力因子Bmp1的功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 呂媛;蘇云金芽胞桿菌Cry1Ac蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的定點(diǎn)突變及結(jié)構(gòu)與功能研究[D];湖南師范大學(xué);2016年

5 朱晨光;蘇云金芽胞桿菌抗病殺蟲和廣譜工程菌的構(gòu)建[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

6 朱莉;蘇云金芽胞桿菌γ-氨基丁酸代謝旁路相關(guān)基因簇的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2007年

7 馮亮;透明顫菌血紅蛋白基因在蘇云金芽胞桿菌中的表達(dá)及對(duì)其發(fā)酵特性的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

8 周琴;綠色熒光蛋白基因在蘇云金芽胞桿菌中的表達(dá)與應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

9 宋萍;蘇云金芽胞桿菌分離鑒定及對(duì)馬鈴薯二十八星瓢蟲特異活性菌株研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 劉梅;禽類病原體抗原在蘇云金芽胞桿菌細(xì)胞表面的展示[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楊云鶴;二點(diǎn)委夜蛾高毒力蘇云金芽胞桿菌殺蟲毒素的篩選及其殺蟲機(jī)理的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 謝盼盼;蘇云金芽胞桿菌aiiA基因5''端側(cè)翼序列的克隆與功能鑒定[D];福建師范大學(xué);2015年

3 黃閩忠;蘇云金芽胞桿菌增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的表達(dá)純化及功能研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 劉婧瑩;牛乳鐵蛋白肽(LfcinB)在蘇云金芽胞桿菌中的融合表達(dá)[D];湖南師范大學(xué);2015年

5 王雷;蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1與PS4蛋白結(jié)構(gòu)的比較與抗癌譜篩選[D];湖南師范大學(xué);2015年

6 黃瓊;蘇云金芽胞桿菌膠原酶ColB1是秀麗小桿線蟲的新型病原因子[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 張路路;蘇云金芽孢桿菌的分離、篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[D];海南大學(xué);2014年

8 宋志儒;蘇云金芽胞桿菌HD12菌株中cry基因的表達(dá)調(diào)控[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2016年

9 賀曉琳;蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體的微膠囊制備[D];北京理工大學(xué);2016年

10 尹學(xué)琳;蘇云金芽胞桿菌的9個(gè)新型殺蟲蛋白基因的克隆、表達(dá)和功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：2366278