【摘要】：昆蟲病原真菌廣泛用于農(nóng)林害蟲的防治,由于其環(huán)境安全性、強(qiáng)致病性以及潛在的流行性,成為很有應(yīng)用潛力的生物制劑。羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robberstii)作為一種昆蟲病原菌的模式生物,一直在昆蟲病原真菌的遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制、致病機(jī)制及生物防治方面的研究中走在前列。類膠原蛋白(collagen-like protein)基因存在于病毒、細(xì)菌和真核生物內(nèi),在調(diào)控生物生長發(fā)育、代謝途徑和致病性等方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明,分析熱激處理的綠僵菌孢子轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜,在所有上調(diào)的基因中,一種類膠原蛋白的基因表達(dá)上調(diào)幅度位居前三,我們推測(cè)類膠原蛋白可能在綠僵菌的抗逆過程起著較為重要的作用。為此,本文對(duì)羅伯茨綠僵菌內(nèi)類膠原蛋白基因(Mcl2)的功能進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,意在闡明Mcl2的遺傳信息,并明確該基因在抗逆、生長發(fā)育以及殺蟲能力等方面的作用,為人工創(chuàng)制高效殺蟲轉(zhuǎn)基因綠僵菌菌株提供新基因儲(chǔ)備。本研究首先對(duì)綠僵菌類膠原蛋白基因克隆注釋,獲得Mcl2遺傳信息;其次利用同源重組的原理,運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法,獲得該基因的敲除菌株及回補(bǔ)菌株。最后,通過對(duì)野生型菌株、敲除突變體菌株和回補(bǔ)突變體菌株表型的分析,獲得Mcl2功能特征。具體的研究結(jié)果如下:(1)通過RACE克隆與測(cè)序方法,得到了Mcl2的cDNA全長序列,并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)信息注釋,而且通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,表明本研究的這種羅伯茨綠僵菌基因(Mcl2)可能是一種新的類膠原蛋白基因。(2)通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pDHt-SK-Mcl2L-BAR-Mcl2R和pDHt-SK-Mcl2-BEN,再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和同源重組基因敲除的方法,最后成功得到?Mcl2(敲除突變體)和?Mcl2/Mcl2(回補(bǔ)突變體)。(3)比較WT(野生型菌株)、?Mcl2(敲除突變體)和?Mcl2/Mcl2(回補(bǔ)突變體)之間的生物學(xué)性狀表明:在PPDA、PDA、SDAY和1/4SDAY培養(yǎng)基上,敲除突變體的菌落顏色和形態(tài)、菌絲生長速度與野生型菌株相比均無顯著差異;而SDAY、1/4SDAY、PPDA及PDA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量略低于野生型菌株,分別為下降了8.34%、9.27%、8.45%和9.89%,?Mcl2/Mcl2與WT的產(chǎn)孢量基本一致。(4)對(duì)上述3個(gè)菌株的逆境脅迫分析表明:它們的分生孢子38°C熱激處理2 h,發(fā)現(xiàn)敲除Mcl2后,其分生孢子的萌發(fā)率降為40.19%,與野生型菌株相比降低了34.79%,表明缺失Mcl2的菌株對(duì)外界溫度的變化更敏感。而對(duì)分生孢子紫外照射3 min,敲除菌株分生孢子萌發(fā)率為56.48%,較野生型菌株和回補(bǔ)菌株分別減少9.45%和9.10%,并沒有明顯變化。在化學(xué)試劑脅迫研究中發(fā)現(xiàn),在加入多菌靈、H2O2、SDS、Congo Red等不同化學(xué)物質(zhì)的PDA培養(yǎng)基中,敲除突變體的生長狀況與野生型亦無明顯差異。(5)用這3種不同菌株的分生孢子(107 conidia/mL)侵染大蠟螟,與野生型綠僵菌相比,敲除了Mcl2的綠僵菌侵染能力明顯減弱,在第5天致死率下降了49.74%,且半致死的時(shí)間為7.47±0.7天,相對(duì)延長了2天,說明Mcl2的缺失導(dǎo)致毒力的減弱。綜上所述,這種類膠原蛋白Mcl2的缺失對(duì)羅伯茨綠僵菌的菌絲生長發(fā)育和抗化學(xué)脅迫、紫外以及產(chǎn)孢均無明顯影響,然而數(shù)據(jù)顯示該基因可能在適應(yīng)熱激環(huán)境能力和殺蟲能力方面起重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S476.12

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2366228