【摘要】：鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雛鴨、鵝、火雞和其它禽類感染全身性漿膜炎的病原體,由于它血清型眾多、各血清型之間的交叉保護(hù)率低以及對抗菌藥物的耐藥性,使得鴨疫里氏桿菌病的防控難度日益增大,該病已成為嚴(yán)重危害全球水禽業(yè)的細(xì)菌性疾病之一。蛋白分泌系統(tǒng)和病原菌的致病性是密不可分的,致病菌通過蛋白分泌系統(tǒng)分泌胞外酶、蛋白酶、毒力因子等破壞宿主細(xì)胞,引起病理損傷和組織壞死。Por分泌系統(tǒng)(Por protein secretion system,PorSS),又被稱為IX型分泌系統(tǒng)(T9SS),目前發(fā)現(xiàn)僅分布于擬桿菌門成員中,介導(dǎo)擬桿菌門細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、蛋白分泌及致病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室已完成鴨疫里氏桿菌血清1型云夢分離株(RA-YM)的基因組測序,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因組存在完整的編碼PorSS的基因。因此,本研究針對RA-YM的PorSS系統(tǒng)SprA基因進(jìn)行缺失,并開展對缺失株ΔsprA其生物學(xué)特性和致病性的研究;同時(shí)提取野生株RA-YM和缺失株ΔsprA的外膜蛋白,利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem Mass Tags,TMT)相對定量蛋白組學(xué)技術(shù)分析RA-YM和ΔsprA差異外膜蛋白,發(fā)掘通過PorSS分泌的外膜蛋白,明確PorSS分泌到外膜的蛋白與鴨疫里氏桿菌致病性的關(guān)系。本研究取得的結(jié)果如下:1.鴨疫里氏桿菌sprA基因缺失突變株的構(gòu)建與生物學(xué)特性研究擴(kuò)增出sprA基因的左、右同源臂(L、R)和壯觀霉素抗性基因(S),利用overlap PCR的方法將L、S、R融合,構(gòu)建抗性基因表達(dá)盒LSR,將LSR連至p RE112,構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pRE-LSR。將重組自殺性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli X7213中,挑取陽性克隆,以含有pRE-LSR的E.coli X7213為供體菌,RA-YM為受體菌,進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移試驗(yàn),在含壯觀霉素的平板上挑選陽性菌落并利用雙重PCR鑒定缺失株。得到缺失株后在含壯觀霉素的TSA平板上盲傳5代評價(jià)其遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)研究了ΔsprA與RA-YM的生長特性和生化特性,結(jié)果顯示在對數(shù)早期ΔsprA在TSB生長速度快于野生株RA-YM(P0.05),后期生長速度沒有顯著性差異;ΔsprA與野生株RA-YM的基本生化特性基本一致,都不發(fā)酵糖類,可以利用尿素,野生株RA-YM可以液化明膠,ΔsprA不能液化明膠。在12.5%鴨血清中缺失株ΔsprA的存活率顯著低于同等條件下野生株RA-YM的存活率(P0.01)。2.RA-YM株與ΔsprA對雛鴨致病性的研究對13日齡的櫻桃谷肉鴨進(jìn)行感染試驗(yàn),感染途徑腿部肌肉注射,結(jié)果顯示野生株RA-YM的LD50為7.21×104 CFU,缺失突變株ΔsprA的LD50為3.61×107 CFU,與RA-YM相比,ΔsprA的毒力下降了約501倍。比較野生株和缺失突變株的載菌量,結(jié)果表明在感染24h后,ΔsprA在血液和脾臟組織中的載菌量低于RA-YM(P0.05);在感染48h后,ΔsprA在血液、肝臟、脾臟和腦組織中的載菌量低于RA-YM(P0.05)。組織剖檢和病理切片觀察結(jié)果也表明,心臟、肝臟、脾臟和腦的病變程度,缺失突變株ΔsprA較野生株RA-YM輕微。3.RA-YM株與ΔsprA的明膠酶譜試驗(yàn)及LC-MS/MS測序分析生化試驗(yàn)結(jié)果顯示野生株RA-YM能液化明膠,缺失突變株ΔsprA不能液化明膠;明膠酶譜試驗(yàn)結(jié)果顯示,野生株RA-YM和缺失株ΔsprA存在三條差異性條帶,經(jīng)蛋白質(zhì)測序及生物信息學(xué)分析,獲得7個(gè)通過PorSS分泌的蛋白,其中絲氨酸S8家族蛋白酶RAYM_04099、RAYM_01812和帶有金屬磷酸酶保守結(jié)構(gòu)域RAYM_03382可能是導(dǎo)致明膠液化、毒力下降的原因。4.鴨疫病里氏桿菌外膜蛋白串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽相對定量蛋白組學(xué)(TMT)分析使用Na2CO3法提取了野生株RA-YM和缺失突變株ΔsprA的外膜蛋白,利用TMT分析外膜蛋白差異。蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果顯示,一共鑒定到1387個(gè)蛋白,213個(gè)外膜蛋白,差異表達(dá)外膜蛋白共有65個(gè),其中上調(diào)蛋白43個(gè),下調(diào)蛋白22個(gè)。將差異表達(dá)的外膜蛋白進(jìn)行GO聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些蛋白參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)的酶解、細(xì)菌的氧化平衡、DNA的代謝過程等生物過程,與蛋白結(jié)合活性、受體活性、DNA結(jié)合活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能相關(guān);對鑒定到蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,共找到12個(gè)通過PorSS分泌的蛋白,包括4個(gè)上調(diào)蛋白,1個(gè)下調(diào)蛋白。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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3 潘艷;謝宇舟;陳澤祥;謝永平;李軍;許力干;楊威;yば郾，

本文編號(hào)：2334683