【摘要】：背景:腫瘤由原位損傷發(fā)展為侵襲性、轉(zhuǎn)移性疾病的進(jìn)展過(guò)程中血管新生起到了關(guān)鍵的作用,該機(jī)制為抗血管生成治療的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)A通過(guò)結(jié)合及激活酪氨酸激酶受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGFR)-1和VEGFR2來(lái)促進(jìn)血管新生,在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族中對(duì)血管新生中起了主要作用。CD47(整合素相關(guān)蛋白;IAP)是免疫球蛋白家族的一種跨膜蛋白,其可以作為血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin,TSP-1)的受體。TSP1與CD47之間的相互作用主要通過(guò)抑制VEGFR2來(lái)抑制內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及血小板的一氧化氮(nitric oxide,NO)信號(hào)通路。TSP1也具有抑制血管新生的作用。目前已證實(shí)TSP1通過(guò)與VEGF的直接結(jié)合來(lái)抑制血管生成。此外,TSP1阻斷CD47與VEGFR2之間的相互作用也可抑制VEGFR2信號(hào),這提示我們CD47參與了TSP1對(duì)血管新生的抑制過(guò)程。CD47也可作為一種信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(signal-regulatory proteinα,SIRPα)的抑制受體表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面。巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)中的CD47與SIRPα結(jié)合后表達(dá)了“別吃我”信號(hào)。CD47的表達(dá)量在多種腫瘤細(xì)胞中均上升,而注射了CD47的阻斷抗體來(lái)阻斷CD47-SIRPα信號(hào)通路則已證實(shí)可以誘導(dǎo)抗腫瘤的免疫反應(yīng)。但是,抗-CD47抗體通過(guò)其自身的作用來(lái)調(diào)節(jié)血管新生進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展的機(jī)制存在與否及其作用機(jī)制目前尚未明確。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)對(duì)野生型(WT)與CD47基因缺陷(CD47-/-)小鼠注射同基因型的腫瘤細(xì)胞后進(jìn)行比較,觀察CD47在非腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)對(duì)腫瘤形成的影響。探討腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中CD47缺乏促進(jìn)血管新生的同時(shí)提高血管的完整性及穩(wěn)定性,進(jìn)而致使腫瘤進(jìn)展加快這一機(jī)制。研究抗CD47靶向抗體通過(guò)阻斷TSP1-CD47信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)血管新生的治療前景。通過(guò)小鼠部分肝臟切除后的類似現(xiàn)象,來(lái)進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論。實(shí)驗(yàn)方法:將RM1細(xì)胞(前列腺癌RM1細(xì)胞系)注射于WT及CD47-/-B6小鼠的腹股溝處,在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間處死小鼠并通過(guò)測(cè)量腫瘤的體積和重量來(lái)評(píng)估腫瘤進(jìn)展。將小鼠兩側(cè)的中葉及左側(cè)葉的肝臟迅速結(jié)扎并切除,適時(shí)處死小鼠后取出肝臟并在術(shù)前及術(shù)后采集血液標(biāo)本。通過(guò)蘇木素-伊紅及免疫組化染色來(lái)分析腫瘤和肝臟組織。留取腫瘤和肝臟組織于液氮冷凍并提取RNA以用于進(jìn)一步分析。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:CD47-/-小鼠中的RM1腫瘤進(jìn)展明顯加快。對(duì)比注射11天后移除的腫瘤,CD47-/-小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量更大。WT小鼠腫瘤中的壞死區(qū)域較多而CD47-/-小鼠的腫瘤中卻極少。來(lái)源于CD47-/-小鼠的腫瘤組織中血管數(shù)量較WT組明顯增多,同時(shí)CD31 m RNA的表達(dá)量也明顯增高。而CD47-/-小鼠腫瘤的乏氧誘導(dǎo)因子-1A水平較WT組相比明顯降低。隨后我們發(fā)現(xiàn)CD47-/-小鼠腫瘤中的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial,VE)-鈣粘素表達(dá)較WT組相比增多,這意味著內(nèi)皮細(xì)胞上的CD47可能抑制VE-鈣粘素表達(dá)。對(duì)CD47-/-小鼠腫瘤的免疫組化分析提示其VEGF-A及VEGFR2的表達(dá)均較WT組顯著增高,實(shí)時(shí)定量PCR的分析也證實(shí)CD47-/-小鼠腫瘤中VEGF-A及VEGFR2 m RNA的表達(dá)均較WT組顯著增高。之后我們檢測(cè)了腫瘤中TSP1的表達(dá)量。與免疫組化及實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)結(jié)果相一致,對(duì)比WT組,來(lái)源于CD47-/-小鼠腫瘤的TSP1的生成量明顯降低。而CD47-/-小鼠腫瘤中F4/80+細(xì)胞—浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的數(shù)量較WT組也明顯降低。在體外實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)穿膜實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)驗(yàn)證巨噬細(xì)胞的遷移性。首先我們證實(shí)出巨噬細(xì)胞的招募對(duì)TSP1具有劑量依賴性。然后我們明確了來(lái)源于WT小鼠腫瘤的TSP1的表達(dá)水平明顯高于CD47-/-小鼠。來(lái)源于WT小鼠的腫瘤細(xì)胞所處的細(xì)胞懸液相比于CD47-/-小鼠具有更強(qiáng)的招募巨噬細(xì)胞的能力。而外源性TSP1加入到CD47-/-小鼠的腫瘤細(xì)胞懸液的環(huán)境中后,其對(duì)巨噬細(xì)胞的招募明顯加強(qiáng)。另外,我們也發(fā)現(xiàn)了,雖然WT腫瘤細(xì)胞懸液對(duì)WT巨噬細(xì)胞的招募作用更明顯,但WT小鼠的腫瘤細(xì)胞對(duì)CD47-/-小鼠巨噬細(xì)胞也具有很強(qiáng)的招募作用。因此,CD47-/-小鼠腫瘤中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)主要是由于其腫瘤中TSP1生成量的減少,而非巨噬細(xì)胞的CD47基因缺陷。在小鼠部分肝臟切除模型中,我們發(fā)現(xiàn)CD47-/-小鼠新生肝臟的CD31及CD34 m RNA的表達(dá)量較WT小鼠相比明顯增多。之后我們又明確了VEGF及VEGFR2 m RNA在WT小鼠的新生肝臟中明顯低于CD47-/-小鼠。免疫組化分析提示來(lái)源于CD47-/-小鼠的新生肝臟對(duì)巨噬細(xì)胞的招募較WT組小鼠下降。結(jié)論:(1)CD47基因缺失小鼠的腫瘤基質(zhì)細(xì)胞加快腫瘤進(jìn)展的同時(shí)減少壞死的形成;(2)CD47基因缺失環(huán)境下小鼠腫瘤的血管新生加快且血管更完整;(3)CD47基因缺失環(huán)境下小鼠的腫瘤增加VEGF及VEGFR2的表達(dá)量;(4)CD47基因缺失小鼠的腫瘤中降低TSP1表達(dá)量的同時(shí)招募的巨噬細(xì)胞數(shù)目減少;(5)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的減少是由于CD47基因缺失小鼠腫瘤環(huán)境中TSP1產(chǎn)生減少所致;(6)CD47基因缺失小鼠經(jīng)部分肝臟切除術(shù)后其肝臟血管新生能力增強(qiáng),同時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞的招募減少。我們的實(shí)驗(yàn)提出了抗-CD47抗體在腫瘤免疫治療中的前景。阻斷腫瘤細(xì)胞上CD47和宿主巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞上信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α之間的相互作用可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答,同時(shí)干擾腫瘤基質(zhì)細(xì)胞(如:內(nèi)皮細(xì)胞)的TSP1-CD47信號(hào)通路可能加快腫瘤的進(jìn)展。我們的實(shí)驗(yàn)也提出了CD47在組織的血管新生中的重要作用,以及TSP1對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2332200