【摘要】：背景:腫瘤由原位損傷發(fā)展為侵襲性、轉(zhuǎn)移性疾病的進(jìn)展過程中血管新生起到了關(guān)鍵的作用,該機(jī)制為抗血管生成治療的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)A通過結(jié)合及激活酪氨酸激酶受體血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGFR)-1和VEGFR2來促進(jìn)血管新生,在血管內(nèi)皮生長因子家族中對血管新生中起了主要作用。CD47(整合素相關(guān)蛋白;IAP)是免疫球蛋白家族的一種跨膜蛋白,其可以作為血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin,TSP-1)的受體。TSP1與CD47之間的相互作用主要通過抑制VEGFR2來抑制內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及血小板的一氧化氮(nitric oxide,NO)信號通路。TSP1也具有抑制血管新生的作用。目前已證實TSP1通過與VEGF的直接結(jié)合來抑制血管生成。此外,TSP1阻斷CD47與VEGFR2之間的相互作用也可抑制VEGFR2信號,這提示我們CD47參與了TSP1對血管新生的抑制過程。CD47也可作為一種信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal-regulatory proteinα,SIRPα)的抑制受體表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)中的CD47與SIRPα結(jié)合后表達(dá)了“別吃我”信號。CD47的表達(dá)量在多種腫瘤細(xì)胞中均上升,而注射了CD47的阻斷抗體來阻斷CD47-SIRPα信號通路則已證實可以誘導(dǎo)抗腫瘤的免疫反應(yīng)。但是,抗-CD47抗體通過其自身的作用來調(diào)節(jié)血管新生進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展的機(jī)制存在與否及其作用機(jī)制目前尚未明確。實驗?zāi)康?通過對野生型(WT)與CD47基因缺陷(CD47-/-)小鼠注射同基因型的腫瘤細(xì)胞后進(jìn)行比較,觀察CD47在非腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)對腫瘤形成的影響。探討腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中CD47缺乏促進(jìn)血管新生的同時提高血管的完整性及穩(wěn)定性,進(jìn)而致使腫瘤進(jìn)展加快這一機(jī)制。研究抗CD47靶向抗體通過阻斷TSP1-CD47信號通路來促進(jìn)血管新生的治療前景。通過小鼠部分肝臟切除后的類似現(xiàn)象,來進(jìn)一步證實上述結(jié)論。實驗方法:將RM1細(xì)胞(前列腺癌RM1細(xì)胞系)注射于WT及CD47-/-B6小鼠的腹股溝處,在適當(dāng)?shù)臅r間處死小鼠并通過測量腫瘤的體積和重量來評估腫瘤進(jìn)展。將小鼠兩側(cè)的中葉及左側(cè)葉的肝臟迅速結(jié)扎并切除,適時處死小鼠后取出肝臟并在術(shù)前及術(shù)后采集血液標(biāo)本。通過蘇木素-伊紅及免疫組化染色來分析腫瘤和肝臟組織。留取腫瘤和肝臟組織于液氮冷凍并提取RNA以用于進(jìn)一步分析。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞穿膜實驗通過流式細(xì)胞術(shù)來分析。實驗結(jié)果:CD47-/-小鼠中的RM1腫瘤進(jìn)展明顯加快。對比注射11天后移除的腫瘤,CD47-/-小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量更大。WT小鼠腫瘤中的壞死區(qū)域較多而CD47-/-小鼠的腫瘤中卻極少。來源于CD47-/-小鼠的腫瘤組織中血管數(shù)量較WT組明顯增多,同時CD31 m RNA的表達(dá)量也明顯增高。而CD47-/-小鼠腫瘤的乏氧誘導(dǎo)因子-1A水平較WT組相比明顯降低。隨后我們發(fā)現(xiàn)CD47-/-小鼠腫瘤中的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial,VE)-鈣粘素表達(dá)較WT組相比增多,這意味著內(nèi)皮細(xì)胞上的CD47可能抑制VE-鈣粘素表達(dá)。對CD47-/-小鼠腫瘤的免疫組化分析提示其VEGF-A及VEGFR2的表達(dá)均較WT組顯著增高,實時定量PCR的分析也證實CD47-/-小鼠腫瘤中VEGF-A及VEGFR2 m RNA的表達(dá)均較WT組顯著增高。之后我們檢測了腫瘤中TSP1的表達(dá)量。與免疫組化及實時定量PCR的檢測結(jié)果相一致,對比WT組,來源于CD47-/-小鼠腫瘤的TSP1的生成量明顯降低。而CD47-/-小鼠腫瘤中F4/80+細(xì)胞—浸潤巨噬細(xì)胞的數(shù)量較WT組也明顯降低。在體外實驗中,我們通過穿膜實驗來對驗證巨噬細(xì)胞的遷移性。首先我們證實出巨噬細(xì)胞的招募對TSP1具有劑量依賴性。然后我們明確了來源于WT小鼠腫瘤的TSP1的表達(dá)水平明顯高于CD47-/-小鼠。來源于WT小鼠的腫瘤細(xì)胞所處的細(xì)胞懸液相比于CD47-/-小鼠具有更強(qiáng)的招募巨噬細(xì)胞的能力。而外源性TSP1加入到CD47-/-小鼠的腫瘤細(xì)胞懸液的環(huán)境中后,其對巨噬細(xì)胞的招募明顯加強(qiáng)。另外,我們也發(fā)現(xiàn)了,雖然WT腫瘤細(xì)胞懸液對WT巨噬細(xì)胞的招募作用更明顯,但WT小鼠的腫瘤細(xì)胞對CD47-/-小鼠巨噬細(xì)胞也具有很強(qiáng)的招募作用。因此,CD47-/-小鼠腫瘤中巨噬細(xì)胞的浸潤主要是由于其腫瘤中TSP1生成量的減少,而非巨噬細(xì)胞的CD47基因缺陷。在小鼠部分肝臟切除模型中,我們發(fā)現(xiàn)CD47-/-小鼠新生肝臟的CD31及CD34 m RNA的表達(dá)量較WT小鼠相比明顯增多。之后我們又明確了VEGF及VEGFR2 m RNA在WT小鼠的新生肝臟中明顯低于CD47-/-小鼠。免疫組化分析提示來源于CD47-/-小鼠的新生肝臟對巨噬細(xì)胞的招募較WT組小鼠下降。結(jié)論:(1)CD47基因缺失小鼠的腫瘤基質(zhì)細(xì)胞加快腫瘤進(jìn)展的同時減少壞死的形成;(2)CD47基因缺失環(huán)境下小鼠腫瘤的血管新生加快且血管更完整;(3)CD47基因缺失環(huán)境下小鼠的腫瘤增加VEGF及VEGFR2的表達(dá)量;(4)CD47基因缺失小鼠的腫瘤中降低TSP1表達(dá)量的同時招募的巨噬細(xì)胞數(shù)目減少;(5)巨噬細(xì)胞浸潤的減少是由于CD47基因缺失小鼠腫瘤環(huán)境中TSP1產(chǎn)生減少所致;(6)CD47基因缺失小鼠經(jīng)部分肝臟切除術(shù)后其肝臟血管新生能力增強(qiáng),同時對巨噬細(xì)胞的招募減少。我們的實驗提出了抗-CD47抗體在腫瘤免疫治療中的前景。阻斷腫瘤細(xì)胞上CD47和宿主巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞上信號調(diào)節(jié)蛋白α之間的相互作用可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答,同時干擾腫瘤基質(zhì)細(xì)胞(如:內(nèi)皮細(xì)胞)的TSP1-CD47信號通路可能加快腫瘤的進(jìn)展。我們的實驗也提出了CD47在組織的血管新生中的重要作用,以及TSP1對巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:BACKGROUND: The development of tumor is a key role in the progression of invasive and metastatic disease, which provides a theoretical basis for the development of anti-angiogenic therapy. Vascular endothelial growth factor (VEGF) A promotes angiogenesis by binding and activating the vascular endothelial growth factor (VEGFR)-1 and VEGFR2 of the tyrosine kinase receptor, and plays a major role in the angiogenesis of the vascular endothelial growth factor. CD47 (integrin-related protein; IAP) is a transmembrane protein of the immunoglobulin family, which can be used as a receptor for platelet-reactive protein-1 (TSP-1). The interaction between TSP1 and CD47 mainly inhibits the signaling pathway of nitric oxide (NO) in endothelial cells, vascular smooth muscle cells and platelets by inhibiting VEGFR2. TSP1 also has the effect of inhibiting angiogenesis. TSP1 has been shown to inhibit angiogenesis by direct binding to VEGF. In addition, the interaction of TSP1 between CD47 and VEGFR2 can also inhibit the VEGFR2 signal, suggesting that we are involved in the inhibition of angiogenesis by TSP1. CD47 may also be expressed in the surface of macrophages and dendritic cells as a suppressor for signal-regulatory protein (SIRP). The 鈥渄on't eat me鈥，

本文編號：2332199