【摘要】：春化階段是小麥生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中一個(gè)及其關(guān)鍵的時(shí)期。本研究從不同春化發(fā)育特性小麥遼春10和京841春化響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組Illumina高通量測(cè)序結(jié)果中,篩選出2個(gè)強(qiáng)烈上調(diào)的ESTs CL13519、Unigene 1312和2個(gè)下調(diào)ESTs Unigene 4460、Unigene 20。以春性小麥遼春10和冬性小麥京841為材料,系統(tǒng)分析了4個(gè)候選ESTs在轉(zhuǎn)錄水平的序列差異及春化處理過程中的表達(dá)特性,利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)進(jìn)行基因功能驗(yàn)證;構(gòu)建CL13519過表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組載體導(dǎo)入擬南芥中,分析轉(zhuǎn)基因材料的生長(zhǎng)發(fā)育特性。主要研究結(jié)果如下:1、以春性品種遼春10號(hào)和冬性品種京841為材料,克隆并分析4個(gè)ESTs的序列差異。結(jié)果顯示:CL13519長(zhǎng)1010 bp,ORF長(zhǎng)681 bp,編碼226個(gè)氨基酸,與Ta HOX1(Gen Bank:JQ915062.1)相似度87.49%;Unigene1312長(zhǎng)度為479 bp,ORF全長(zhǎng)282 bp,5′UTR 169 bp,3′UTR 26 bp,編碼93個(gè)氨基酸,與硬質(zhì)四倍體小麥脫水素(Gen Bank:X78432.1)一致性高達(dá)85%;Unigene4460長(zhǎng)361bp,經(jīng)TAIR在線分析,可能與H3蛋白甲基化相關(guān);Unigene20長(zhǎng)632 bp,與中國春3B染色體上一段序列(Gen Bank:HG670306.1)相似度高達(dá)83.91%,與山羊草hypothetical protein F775_32582序列(Gen Bank:KD510223.1)相似度達(dá)77.15%。2、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了4個(gè)ESTs在不同春化特性小麥中的表達(dá)特性,結(jié)果表明:CL13519、Unigene1312在遼春10號(hào)中表達(dá)量呈拋物線型表達(dá),第5周時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值;Unigene1312在京841中的表達(dá)量呈拋物線型表達(dá),第5周時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值;CL13519在京841中表達(dá)模式中有兩個(gè)峰值,最大值出現(xiàn)在春化處理第五周;Unigene4460在遼春10號(hào)中表達(dá)量呈波動(dòng)式下調(diào)表達(dá);Unigene4460在京841中第1周急劇升高后急劇下降之后一直下調(diào)表達(dá);Unigene20在遼春10號(hào)和京841中均呈波浪型表達(dá),在第5周時(shí)表達(dá)量最低。3、以遼春10號(hào)為試驗(yàn)材料,利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS),成功構(gòu)建了小麥VIGS基因功能驗(yàn)證的技術(shù)體系,并對(duì)所挑選的4個(gè)ESTs進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示:BSMV的侵染對(duì)小麥植株幼穗的分化進(jìn)程產(chǎn)生了一定的影響。本試驗(yàn)中空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組之間小麥幼穗分化幾乎無差異,BSMV:CL13519、BSMV:Unigene1312、BSMV:Unigene20幼穗分化發(fā)育晚于對(duì)照,而BSMV:Unigene4460侵染卻加速了幼穗分化。4、以pCAMBIA3301為表達(dá)載體成功構(gòu)建CL13519過表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化,通過標(biāo)記基因進(jìn)行除草劑抗性篩選以及PCR鑒定,得到陽性轉(zhuǎn)基因T1代植株,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)T1代轉(zhuǎn)基因植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)早于野生型植株。
[Abstract]:The vernalization stage is an important stage in wheat growth and development. In this study, two highly up-regulated ESTs CL13519,Unigene 1312 and two down-regulated ESTs Unigene 4460 Unigene 20 were screened from the high-throughput Illumina sequencing results of the vernalization response transcriptional sets of wheat Liaochun 10 and Jing841 with different vernalization developmental characteristics. Using the spring wheat Liaochun 10 and winter wheat Jing841 as materials, the sequence differences of four candidate ESTs at transcription level and their expression characteristics during vernalization were systematically analyzed, and the gene function was verified by virus-induced gene silencing. CL13519 overexpression vector was constructed and the recombinant vector was introduced into Arabidopsis thaliana by Agrobacterium tumefaciens to analyze the growth and development characteristics of transgenic materials. The main results are as follows: 1. Using the spring variety Liaochun 10 and winter variety Jing841 as materials, the sequence differences of four ESTs were cloned and analyzed. The results showed that CL13519 length 1010 bp,ORF length 681 bp, encode 226 amino acids, and the similarity with Ta HOX1 (Gen Bank:JQ915062.1) is 87.49%. The length of bp,ORF is 282 bp,5'UTR 169 bp,3'UTR 26 bp, which encodes 93 amino acids. The consistency with hard tetraploid wheat dehydrin (Gen Bank:X78432.1) is as high as 851 BP by TAIR on-line analysis. The similarity between Unigene20 length 632 bp, and Chinese Spring 3B chromosome (Gen Bank:HG670306.1) is as high as 83.91l, and the similarity with hypothetical protein F775Serial 32582 (Gen Bank:KD510223.1) is 77.150.The four ESTs were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. Vernalization characteristics in wheat, The results showed that the expression of CL13519,Unigene1312 was parabolic in Liaochun 10, and reached the maximum at the 5th week, and the expression of Unigene1312 in Jing841 was parabola. At the 5th week, the expression of CL13519 reached its maximum value, and there were two peaks in the expression pattern of CL13519 in Jing841. The maximum value appeared in the fifth week of vernalization, the expression of Unigene4460 in Liaochun 10 was down-regulated, the expression of Unigene4460 in Jing841 increased sharply in the first week and then decreased sharply, and the expression of Unigene20 was wave-like in Liaochun 10 and Jing841. At the fifth week, the lowest expression was found. 3. Using Liaochun 10 as the experimental material, the functional verification system of wheat VIGS gene was successfully constructed by virus induced gene silencing technique (VIGS), and the four selected ESTs were verified and analyzed. The results showed that BSMV infection had a certain effect on the process of spike differentiation of wheat plants. In this experiment, there was almost no difference between the blank control group, the negative control group and the positive control group. The spike differentiation of BSMV:CL13519,BSMV:Unigene1312,BSMV:Unigene20 was later than that of the control, but the BSMV:Unigene4460 infection accelerated the spike differentiation. 4. The CL13519 overexpression vector was successfully constructed with pCAMBIA3301 as expression vector. Through Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Arabidopsis thaliana, herbicide resistance screening and PCR identification of marker genes, positive transgenic T1 plants were obtained. Reproductive growth was earlier than wild-type plants.
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S512.1

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本文編號(hào)：2291751