【摘要】：達(dá)氏鰉,俗稱鰉魚。物種起源于距今一億三千萬年的白堊紀(jì),是全世界惟有黑龍江流域才有的珍貴魚類。作為白堊紀(jì)時(shí)期保存下來的古生物群之一,曾與恐龍?jiān)诘厍蛏瞎餐钸^,其原始古樸的外形1億多年來幾乎沒有改變,具有珍貴的科研價(jià)值。達(dá)氏鰉現(xiàn)為國家二級野生保護(hù)動物,1998年聯(lián)合國華盛頓公約將其認(rèn)定為瀕危物種。除此之外,達(dá)氏鰉具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其魚卵被稱為“黑黃金”,魚子醬是極其美味。而達(dá)氏鰉的生長尤為緩慢,性成熟周期在18年以上,因此探究達(dá)氏鰉的繁育生理勢在必行。促性腺激素(gonadotropin hormone,GtH)是由脊椎動物腦垂體分泌的促進(jìn)性腺發(fā)育和繁殖的主要內(nèi)分泌因素。主要包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormon,LH)、促甲狀腺素(throtroid stimulating horme,TSH)同構(gòu)成的糖蛋白激素家族。由垂體分泌的促性腺激素的生成和釋放受促黃體生成素釋放激素(LH-RH)和促卵泡激素釋放激素(FSH-RH)直接調(diào)控。魚類的性成熟與促性腺激素的分泌直接相關(guān),因此利用生物學(xué)手段,加快開展促性腺激素基因的研究至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)對達(dá)氏鰉促性腺激素FSHβ亞基和LHβ亞基進(jìn)行了基因克隆,采用的是反轉(zhuǎn)錄法(RT-PCR)和快速cDNA末端擴(kuò)增法(RACE),并對其cDNA全長的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹以及對其氨基酸進(jìn)行了同源對比分析。同時(shí),應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分別對達(dá)氏鰉促性腺激素FSHβ亞基和LHβ亞基在十種組織中的表達(dá)量進(jìn)行了分析。此外,將促性腺激素的開放閱讀框?qū)氪竽c桿菌中進(jìn)行了原核表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增中間片段,并用RACE方法擴(kuò)增3’端和5’端,最后拼接c DNA全長,LHβ亞基cDNA全長596bp,FSH亞基cDNA全長1090bp,開放閱讀框?yàn)?14bp和387bp,分別編碼了137和129個(gè)氨基酸。經(jīng)過Blast比對分析,與其它鱘鰉魚類相比,其氨基酸相似性均高達(dá)98%以上。對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、疏水性、跨膜區(qū)進(jìn)行了分析,并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),其與中華鱘親緣關(guān)系較近,與其它硬骨魚類較遠(yuǎn),與哺乳動物中的人和小鼠最遠(yuǎn)。(2)對達(dá)氏鰉腦垂體、腦、肌肉、精巢、卵巢、肝、腎、腸、胃、鰓10個(gè)組織進(jìn)行了熒光定量分析。結(jié)果表明,FSH亞基和LH亞基在大多數(shù)的組織表達(dá)量上具有一致性,腦垂體表達(dá)量最高且尤為顯著,在精巢和卵巢中有所表達(dá),在腦中有微量的表達(dá),在其他組織中幾乎不表達(dá)。而兩個(gè)亞基的差異主要體現(xiàn)于性腺上,FSH亞基在精巢中表達(dá)較高,而LH亞基在卵巢中表達(dá)量較高。(3)將達(dá)氏鰉促性腺激素LHβ亞基和FSHβ亞基的開放閱讀框?qū)隑lunt-E1中,再將其質(zhì)粒提取轉(zhuǎn)入BL21(DE3)里構(gòu)建成原核表達(dá)載體,之后再用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行蛋白表達(dá),蛋白大小均在14kDa左右。優(yōu)化其表達(dá)條件,結(jié)果表明IPTG的濃度對蛋白表達(dá)量幾乎沒有影響,而最優(yōu)表達(dá)條件為:37℃誘導(dǎo)5h。再以此條件進(jìn)行蛋白大量培養(yǎng),經(jīng)過蛋白純化和western blot鑒定,結(jié)果顯示出融合蛋白可以與克隆抗體相結(jié)合,免疫學(xué)活性良好,表明融合蛋白可以在BL21(DE3)中成功表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2291665