【摘要】：達氏鰉,俗稱鰉魚。物種起源于距今一億三千萬年的白堊紀,是全世界惟有黑龍江流域才有的珍貴魚類。作為白堊紀時期保存下來的古生物群之一,曾與恐龍在地球上共同生活過,其原始古樸的外形1億多年來幾乎沒有改變,具有珍貴的科研價值。達氏鰉現為國家二級野生保護動物,1998年聯(lián)合國華盛頓公約將其認定為瀕危物種。除此之外,達氏鰉具有很高的經濟價值,其魚卵被稱為“黑黃金”,魚子醬是極其美味。而達氏鰉的生長尤為緩慢,性成熟周期在18年以上,因此探究達氏鰉的繁育生理勢在必行。促性腺激素(gonadotropin hormone,GtH)是由脊椎動物腦垂體分泌的促進性腺發(fā)育和繁殖的主要內分泌因素。主要包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormon,LH)、促甲狀腺素(throtroid stimulating horme,TSH)同構成的糖蛋白激素家族。由垂體分泌的促性腺激素的生成和釋放受促黃體生成素釋放激素(LH-RH)和促卵泡激素釋放激素(FSH-RH)直接調控。魚類的性成熟與促性腺激素的分泌直接相關,因此利用生物學手段,加快開展促性腺激素基因的研究至關重要。本實驗對達氏鰉促性腺激素FSHβ亞基和LHβ亞基進行了基因克隆,采用的是反轉錄法(RT-PCR)和快速cDNA末端擴增法(RACE),并對其cDNA全長的序列進行了生物信息學分析,構建系統(tǒng)進化樹以及對其氨基酸進行了同源對比分析。同時,應用實時熒光定量PCR技術,分別對達氏鰉促性腺激素FSHβ亞基和LHβ亞基在十種組織中的表達量進行了分析。此外,將促性腺激素的開放閱讀框導入大腸桿菌中進行了原核表達。實驗結果如下:(1)設計特異性引物擴增中間片段,并用RACE方法擴增3’端和5’端,最后拼接c DNA全長,LHβ亞基cDNA全長596bp,FSH亞基cDNA全長1090bp,開放閱讀框為414bp和387bp,分別編碼了137和129個氨基酸。經過Blast比對分析,與其它鱘鰉魚類相比,其氨基酸相似性均高達98%以上。對蛋白質的二級結構、三級結構、疏水性、跨膜區(qū)進行了分析,并構建了系統(tǒng)進化樹。構建了系統(tǒng)進化樹發(fā)現,其與中華鱘親緣關系較近,與其它硬骨魚類較遠,與哺乳動物中的人和小鼠最遠。(2)對達氏鰉腦垂體、腦、肌肉、精巢、卵巢、肝、腎、腸、胃、鰓10個組織進行了熒光定量分析。結果表明,FSH亞基和LH亞基在大多數的組織表達量上具有一致性,腦垂體表達量最高且尤為顯著,在精巢和卵巢中有所表達,在腦中有微量的表達,在其他組織中幾乎不表達。而兩個亞基的差異主要體現于性腺上,FSH亞基在精巢中表達較高,而LH亞基在卵巢中表達量較高。(3)將達氏鰉促性腺激素LHβ亞基和FSHβ亞基的開放閱讀框導入Blunt-E1中,再將其質粒提取轉入BL21(DE3)里構建成原核表達載體,之后再用IPTG誘導進行蛋白表達,蛋白大小均在14kDa左右。優(yōu)化其表達條件,結果表明IPTG的濃度對蛋白表達量幾乎沒有影響,而最優(yōu)表達條件為:37℃誘導5h。再以此條件進行蛋白大量培養(yǎng),經過蛋白純化和western blot鑒定,結果顯示出融合蛋白可以與克隆抗體相結合,免疫學活性良好,表明融合蛋白可以在BL21(DE3)中成功表達。
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【學位授予單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2291665