【摘要】：生物的雌雄二態(tài)性的存在為后代的繁殖和發(fā)展提供了重要條件。哺乳動物雌雄二態(tài)性的最直接特征就是雌雄比例的平衡和差異。而Zfx(Zinc finger-X,Zfx)基因及其家族則是影響哺乳動物雌雄比例平衡的重要因子。Zfx是一種位于X染色體上的能夠編碼鋅指狀蛋白的特異基因,存在于雄性哺乳動物睪丸組織的曲精細(xì)管中單倍體X生精細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),具有轉(zhuǎn)錄激活的功能,可能直接或間接參與X精子的發(fā)育和生成。本研究參照豬的Zfx基因的序列特征,按照RNA干擾片段的設(shè)計(jì)原則,合成不經(jīng)過病毒包裝的PLL3.7質(zhì)粒載體,實(shí)驗(yàn)室模擬豬睪丸生精細(xì)胞環(huán)境創(chuàng)建生精細(xì)胞和支持細(xì)胞共培養(yǎng)體系,經(jīng)過體外離體培養(yǎng)轉(zhuǎn)染,在mRNA水平檢測干擾載體效果,然后優(yōu)選干擾載體,優(yōu)化實(shí)體干擾效果,采用散點(diǎn)睪丸注射的方式,分不同劑量和針次梯度對公豬睪丸進(jìn)行注射干擾試驗(yàn)。經(jīng)隨機(jī)分群和人工授精,追蹤記錄其后代性別及其繁殖性能。從而探討干擾豬Zfx基因性控效果及對母豬繁殖性能的影響。具體研究結(jié)果如下:1、豬Zfx基因RNAi重組載體的構(gòu)建依據(jù)NCBI的Gene bank中的豬Zfx基因的Nucleotide核苷酸序列,參照siRNA設(shè)計(jì)步驟,設(shè)計(jì)1條符合條件的siRNA,再選擇PLL3.7合適的酶切位點(diǎn),合成相對應(yīng)的shRNA,經(jīng)過合鏈和酶切連接,測序及PCR鑒定,成功構(gòu)建干擾載體PLL3.7/N。2、干擾載體細(xì)胞水平的驗(yàn)證采集30日齡左右的仔豬睪丸,通過反轉(zhuǎn)錄和相對實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證在細(xì)胞水平下,干擾載體PLL3.7/N引起生精細(xì)胞mRNA表達(dá)顯著下降。其Zfx基因的mRNA表達(dá)量為44%,與對照組相比差異顯著(P0.05)。3、豬體內(nèi)干擾試驗(yàn)通過無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒,純化富集出高純度和濃度的原核表達(dá)克隆的PLL3.7/N干擾載體。選取健康種公豬18頭,隨機(jī)分為6組,每組各3頭,用高壓滅菌的PBS,按照終體積7mL,0.5mg/管、1.0mg/管、1.5mg/管的劑量,對照組為PLL3.7空載體,劑量為1.5mg/管,臨近注射前每管添加1mL雙抗混勻。兩側(cè)睪丸,每間隔10天注射一針,共連續(xù)注射3針后(另外6頭公豬分別為1.5mg/側(cè)共注射一針組、1.5mg/側(cè)共注射兩針組),休養(yǎng)4天并排精后安排相同飼養(yǎng)條件下分欄飼喂,采集精液,檢測鑒定精液品質(zhì),并進(jìn)行人工授精,配種時(shí)間為60天(一針組配30天、兩針組配20天),保證每個試驗(yàn)組每天都有1頭公豬與2頭以上的母豬配種。人工授精配種后,統(tǒng)計(jì)產(chǎn)仔性別比例。結(jié)果表明:總體數(shù)據(jù)顯示,第3次注射質(zhì)粒后,0.5mg/側(cè)三針組雄性仔豬比例為54.1%,與對照組性別比例相比差異不顯著(P0.05)。1.0mg/側(cè)三針組雄性仔豬比例為63.2%,與對照組相比差異極顯著(P0.01)。1.5mg/側(cè)三針組雄性仔豬比例為68.82%,與對照組相比差異極顯著(P0.01)。1.5mg/側(cè)共注射兩針組雄性仔豬比例為61.72%,與對照組相比差異極顯著(P0.01)。1.5mg/側(cè)共注射一針組雄性仔豬比例為48.22%,與對照組相比差異不顯著(P0.05)。分時(shí)間間隔顯示,第3次注射質(zhì)粒后,在第1、2、3個月,0.5mg/側(cè)三針組產(chǎn)雄性仔豬的比例分別是56.08%、53.14%、50.79%,與對照組相比均差異不顯著(P0.05);1.0mg/側(cè)三針組產(chǎn)雄性仔豬的比例分別是66.67%、63.9%、53.13%,與對照組相比分別是差異顯著(P0.05)、差異顯著(P0.05)、差異不顯著(P0.05);1.5mg/側(cè)三針組產(chǎn)雄性仔豬的比例分別是72.28%、70.05%、53.33%,與對照組相比分別是差異極顯著(P0.01)、差異極顯著(P0.01)、差異不顯著(P0.05)。試驗(yàn)說明通過RNA干擾技術(shù)和睪丸局部注射,體內(nèi)定向干擾抑制公豬睪丸中X精子正常發(fā)育,提高Y精子的競爭優(yōu)勢,從而控制豬后代性別的技術(shù)切實(shí)可行。PLL3.7/N質(zhì)粒對Zfx基因的干擾作用與注射次數(shù)、注射劑量和持續(xù)時(shí)間有關(guān),1.5mg/側(cè)的劑量是本試驗(yàn)性控效果最佳的注射劑量。注射時(shí)間方面,從第二針開始,性控效果明顯,1.5mg/側(cè)注射組的雄性仔豬比例達(dá)到61.72%,差異極顯著(P0.01),到第三針達(dá)到68.82%,差異極顯著(P0.01);性控效果有效時(shí)間是從第二針開始的。4、注射重組載體對與配母豬繁殖性能影響的追蹤檢測通過公豬注射后(0.5mg/側(cè)三針組、1.0mg/側(cè)三針組、1.5mg/側(cè)三針組、1.5mg/側(cè)共注射兩針組、1.5mg/側(cè)共注射一針組)與母豬配種,分欄管理飼養(yǎng),并跟蹤記錄統(tǒng)計(jì)相應(yīng)組別人工授精的母豬繁殖性能數(shù)據(jù),包括受胎率、分娩率、窩產(chǎn)仔率、活仔率、健仔率、畸形死胎木乃伊率、初生重、斷乳存活率。結(jié)果顯示:5種注射條件,對與配母豬繁殖性能的影響均不顯著。結(jié)論:通過睪丸注射法,干擾Zfx基因進(jìn)行的豬性別控制,對母豬的繁殖性能沒有影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S828

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 席繼鋒;張永生;王香祖;鄧雙義;賈斌;;利用干擾Zfy基因進(jìn)行湖羊性別控制的研究[J];畜牧與獸醫(yī);2017年02期

2 秦炳燕;孫麗榮;張永生;李超程;席繼峰;王香祖;賈斌;;豬Zfy基因干擾載體的構(gòu)建及性控效果的驗(yàn)證[J];畜牧與獸醫(yī);2016年12期

3 潘宏;段亞萍;李敏玲;陳富美;付強(qiáng);張明;;LAMP法在水牛早期胚胎性別鑒定中的應(yīng)用[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2015年06期

4 劉志國;;CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因組編輯的研究進(jìn)展[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年10期

5 張?jiān)聢A;王昌留;;DMRT基因家族研究進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2013年11期

6 馬世俊;馬軍德;賈斌;申紅;王緒海;張挺軍;郭玉強(qiáng);蔡國寶;;高效抑制小鼠精子zfx基因shRNA分子的篩選[J];石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年04期

7 王惠;錢沖;郭峰;關(guān)超;蘇長青;白洪志;;實(shí)時(shí)定量PCR檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J];種子;2013年06期

8 魯成龍;華松;彭輝;呂品;劉旭;張涌;;哺乳動物X染色體失活機(jī)制及其應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年07期

9 李金峰;彭書];;小干擾RNA的設(shè)計(jì)方法及研究進(jìn)展[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年01期

10 曹謹(jǐn)玲;陳劍杰;甘西;羅永巨;;魚類DMRT基因的研究進(jìn)展[J];廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2011年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 秦炳燕;豬ZFY基因干擾載體構(gòu)建及性控效果的驗(yàn)證[D];石河子大學(xué);2016年

2 吳寧;Sry基因沉默對小鼠胚胎性別決定基因及性腺發(fā)育的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

3 張艷萍;Sry核酸免疫對小鼠性別決定的影響[D];首都師范大學(xué);2006年

，

本文編號：2288284