【摘要】：目的:在建立穩(wěn)定的、可重復(fù)性強(qiáng)的大鼠異位小腸移植急性排斥反應(yīng)模型的基礎(chǔ)上,探討血紅素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSCs)在減輕大鼠小腸移植急性排斥反應(yīng),改善小腸移植大鼠預(yù)后中的作用。方法:本研究首先采用梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)的方法提取Lewis大鼠股骨及脛骨中的BMMSCs,培養(yǎng)至3代以后,通過轉(zhuǎn)染空腺病毒(adenovirus,Ad)以及攜帶有HO-1基因的腺病毒制備腺病毒空載的BMMSCs(Ad/BMMSCs)和HO-1基因修飾的BMMSCs(Ad/HO-1/BMMSCs);以BN大鼠為供體,以Lewis大鼠為受體,建立異位大鼠小腸移植排斥反應(yīng)模型。對照組供受體均為Lewis大鼠。通過大鼠存活情況以及組織病理學(xué)變化分析小腸移植排斥反應(yīng)模型建模是否成功;在成功建模的基礎(chǔ)上,術(shù)后經(jīng)陰莖背靜脈分別給予未處理的BMMSCs、Ad/BMMSCs以及Ad/HO-1/BMMSCs各1×107個,等量的生理鹽水注射作為基礎(chǔ)對照。觀察術(shù)后各組大鼠的生存狀況并分析生存率。分別于術(shù)后1、5、7、10d時搜集移植腸組織檢測組織病理學(xué)以及細(xì)胞凋亡情況,并通過免疫組織化學(xué)、Western Blot、PCR測定移植腸組織中HO-1蛋白以及m RNA的表達(dá)。同時,保留各組血清樣本檢測血清中各種細(xì)胞因子的水平。此外,提取脾臟淋巴細(xì)胞檢測其中NK細(xì)胞(natural killer cell,NK cell)的活性以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)的水平。結(jié)果:經(jīng)培養(yǎng)鑒定,由大鼠股骨及脛骨提取的BMMSCs易培養(yǎng)、數(shù)量多、純度高,腺病毒轉(zhuǎn)染不會改變其生物細(xì)胞學(xué)特性;在反復(fù)預(yù)實(shí)驗練習(xí)后熟練掌握小腸移植技術(shù)。在BN至Lewis的異位小腸移植急性排斥反應(yīng)模型中,術(shù)后3 d內(nèi)無明顯的急性排斥反應(yīng)發(fā)生,術(shù)后5 d時會發(fā)生輕至中度的急性排斥反應(yīng),術(shù)后7 d時會發(fā)生中至重度的急性排斥反應(yīng),而至術(shù)后第10 d,所有的移植大鼠均表現(xiàn)為重度的急性排斥反應(yīng)。隨著急性排斥反應(yīng)的加重,移植小腸表現(xiàn)為越來越嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤、腺窩上皮損傷、腺窩凋亡小體形成、組織結(jié)構(gòu)破壞以及粘膜潰瘍等。幾乎所有的移植大鼠均于14 d天之內(nèi)死亡,中位生存時間為10 d;BMMSCs治療顯著改善了移植大鼠地生存狀況并顯著提高了其術(shù)后生存率,組織病理學(xué)改變明顯改善,排斥指數(shù)、細(xì)胞凋亡及NK細(xì)胞活性顯著下降。血清IL-10、TGF-β等與抗炎或Tregs分化相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高,而與促炎或Th17分化相關(guān)的細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ的表達(dá)水平則明顯降低。此外,BMMSCs還誘導(dǎo)了Tregs的生成。但BMMSCs的以上效應(yīng)一般7 d內(nèi)較強(qiáng),在10 d時便呈下降趨勢;HO-1基因修飾BMMSCs,顯著提高了BMMSCs中HO-1蛋白的表達(dá),提高了BMMSCs在體內(nèi)的存活率,并進(jìn)一步增強(qiáng)了BMMSCs保護(hù)移植小腸的作用。與未處理的BMMSCs治療相比,Ad/HO-1/BMMSCs治療進(jìn)一步提高了移植大鼠術(shù)后生存率,組織病理學(xué)變化及細(xì)胞凋亡進(jìn)一步好轉(zhuǎn),NK細(xì)胞活性顯著下降而Tregs水平顯著升高,細(xì)胞因子IL-10、TGF-β顯著上升而IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ則顯著降低。結(jié)論:大鼠股骨、脛骨提取的BMMSCs數(shù)量多、純度高,是實(shí)驗理想的BMMSCs來源;以腺病毒轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn)BMMSCs的基因修飾是可行的;BMMSCs治療可減輕大鼠異位小腸移植的急性排斥反應(yīng),但受限于BMMSCs在體內(nèi)較低的存活率;HO-1基因修飾BMMSCs可提高BMMSCs在體內(nèi)的存活率,并可進(jìn)一步增強(qiáng)BMMSCs減輕大鼠小腸移植急性排斥反應(yīng),改善小腸移植大鼠預(yù)后的作用。
[Abstract]:Objective: To study the effect of heme oxygenase-1 (HO-1) gene modified bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) on acute rejection in rat small intestine transplantation, on the basis of establishing a stable and repeatable model of acute rejection of ectopic small intestine transplantation in rats. To improve the effect of small intestine transplantation on the prognosis of rats. Methods: The BMMSCs in the femur and tibia of Lewis rats were extracted by the method of gradient centrifugation combined with adherent culture. After three generations, BMMMSCs (Ad/ BMMSCs) and HO-1 gene modified BMMSCs (Ad/ HO-1/ BMMSCs) were transfected with adenovirus containing adenovirus (Ad/ BMMSCs) and HO-1 gene. Using BN rats as donor, Lewis rats were used as recipients to establish a model of rejection of small intestine transplantation in ectopic rats. Both the control group and the recipient were Lewis rats. The model of small intestine transplantation rejection was analyzed by the survival and histopathological changes of rats. After the successful modeling, the untreated BMMSCs, Ad/ BMMSCs and Ad/ HO-1/ BMMSCs were treated as basic control. Survival status and survival rate of each group of rats after operation were observed. Histopathology and apoptosis of transplanted intestinal tissues were collected from 1, 5, 7 and 10 days post-operatively, and the expression of HO-1 protein and m RNA was measured by immunohistochemistry, Western blot and PCR. At the same time, the serum samples of each group were kept to detect the levels of various cytokines in the serum. In addition, spleen lymphocytes were extracted to detect the activity of NK cells and the levels of regulatory T cells (Tregs). Results: After culture and identification, BMMSCs extracted from the femur and tibia of rats were easy to be cultured, the quantity was much, the purity was high, the transfection of adenovirus did not change its biological cytologic characteristics. In the model of acute rejection of BN-Lewis's ectopic small intestine transplantation, there was no significant acute rejection within 3 days after operation, and mild to moderate acute rejection occurred in 5 days after operation. All transplant rats showed severe acute rejection. With the aggravation of acute rejection, the transplanted small intestine shows more and more serious inflammatory cell infiltration, glandular epithelium injury, adenocarcinoma of salivary gland, formation of tissue structure, destruction of tissue structure, and mucosal damage. Almost all of the transplanted rats died within 14 days, and the survival time was 10d; BMMSCs treatment significantly improved the survival condition of transplanted rats and significantly improved the survival rate, the histopathological changes were obviously improved, and the rejection index was improved. Apoptosis and NK cell activity decreased significantly. The levels of IL-10, IL-6, IL-17, IL-23, TNF-and IFN-hIL in serum of IL-10, IL-6, IL-17, IL-23, TNF-, and IFN-hIL were significantly decreased. In addition, BMMSCs also induced Treggs formation. However, the above effect of BMMSCs was strong in 7 days and decreased in 10 days. The HO-1 gene modified BMMSCs significantly improved the expression of HO-1 protein in BMMSCs, increased the survival rate of BMMSCs in vivo, and further enhanced the role of BMMSCs in protecting transplanted small intestine. Compared with untreated BMMSCs, the treatment of Ad/ HO-1/ BMMSCs further improved the survival rate, histopathological changes and apoptosis of transplanted rats, and the activity of NK cells decreased significantly. The levels of IL-10, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23, IL-6, IL-17, IL-23 TNF-IIIa and IFN-IIIa were significantly reduced. Conclusion: The number of BMMSCs extracted from the femur and tibia of rats is high, the purity is high, it is the ideal BBM source of the experiment; the gene modification of BMMSCs can be realized by adenovirus transfection; BMMSCs can reduce the acute rejection response of rat heterotopic small intestine transplantation, but is limited by the low survival rate of BMMSCs in vivo; HO-1 gene modified BMMSCs can improve the survival rate of BMMSCs in vivo, and can further enhance BMMSCs to alleviate acute rejection in rat small intestine transplantation and improve the prognosis of small intestine transplantation rats.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R656.7

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本文編號：2281472